DB50T 427-2012 土壤、沉積物和固體廢物 二惡英類的篩查 酶聯(lián)免疫法

土壤、沉積物和固體廢物二惡英類的篩查酶聯(lián)免疫法Soil,SedimentandSolidWasteScreeningdibenzo-p-dioxins(PCDDs)andpolychlorinateddibenzofura2012-02-15發(fā)布2012-09-01實施Ⅱ 1 4方法原理 25試劑和材料 26儀器設(shè)備 37樣品采集 38樣品前處理 3 6 8 8 916注意事項 9附錄A(規(guī)范性附錄)二惡英類分析流程圖 附錄B(資料性附錄)樣品蒸發(fā)模式 附錄C(資料性附錄)標準溶液濃度序列 附錄D(資料性附錄)標準曲線控制參數(shù) Ⅲ本標準根據(jù)GB/T1.1-2009規(guī)定進行編制。本標準為推薦性標準。本標準為首次發(fā)布。本標準由重慶市環(huán)境保護局提出并歸口。本標準起草單位：重慶市固體廢物管理中心。本標準自2012年9月1日實施。1土壤、沉積物和固體廢物二惡英類的篩查酶聯(lián)免疫法本標準規(guī)定了采用酶聯(lián)免疫法篩查土壤、沉積物和固體廢物(包含飛灰、鹽泥、工業(yè)廢渣、污泥)中的多氯代二苯并二惡英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)方法。本標準適用于土壤、沉積物和固體廢物中二惡英類的篩查，利用酶聯(lián)免疫法篩查土壤、沉積物和固體廢物中的多氯代二苯并二惡英和多氯代二苯并呋喃。2規(guī)范性引用文件下列文件對本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。HJ/T20-1998《工業(yè)固體廢物采樣制樣技術(shù)規(guī)范》HJ/T166-2004《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》HJ494-2009《水質(zhì)采樣技術(shù)指導》3術(shù)語和定義、符號和縮略詞下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1術(shù)語和定義3.1.1二惡英類多氯代二苯并二惡英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的總稱。3.1.2同類物二惡英類所有化合物互為同類物。二惡英類共有210種同類物。3.1.32,3,7,8-多氯代二惡英類指在2,3,7,8位均有氯原子取代的二惡英類同類物，共有17種，其中多氯代二苯并二惡英有7種，多氯代二苯并呋喃有10種。3.1.4毒性當量(TEQ)各二惡英類同類物濃度折算為相當于2,3,7,8-四氯代二苯并二惡英毒性的等價濃度，本標準檢測結(jié)果為Bio-TEQ,經(jīng)換算后可轉(zhuǎn)換為I-TEQ。在20-26℃下，使二惡英類與酶聯(lián)免疫測定管中的抗體充分結(jié)合的過程。3.1.6試劑空白以分析待測樣品溶液所使用的溶劑作為空白，其余操作步驟和實際樣品相同的空白實驗。3.1.7操作空白除不添加實際樣品外，樣品制備、前處理、儀器分析和數(shù)據(jù)處理步驟與實際樣品分析步驟相同的空3.2符號和縮略詞2多氯代二苯并二惡英，有75種同類物。多氯代二苯并呋喃，有135種同類物。2,3,7,8-四氯代二苯并二惡英。辣根過氧化物酶。四乙烯乙二醇。3.2.6DF1-60酶聯(lián)免疫試劑盒本標準采用的一種試劑盒，包含酶聯(lián)免疫測定管，樣品稀釋液，HRP,HRP底物，終止液(1mol/L鹽酸溶液),TritonX-100,保留劑。校正因子。4方法原理酶聯(lián)免疫法的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。參見圖1和附錄A“二惡英分析流程圖”。干擾物抗二惡英抗體ESHRP(辣根過氧化物酶)圖1篩查原理簡單示意圖5試劑和材料除非另有說明，分析試劑均使用農(nóng)殘級試劑，并進行空白實驗。有機溶劑濃縮萬分之一倍，不得檢出二惡英類。35.12,3,7,8-四氯代二苯并二惡英：標準品試劑5.2無水硫酸鈉：分析純5.3酸洗石英砂5.4正己烷5.8正十四烷：分析純5.9鹽酸：優(yōu)級純。5.10二氯甲烷5.11SP3-60試劑盒(含40mL萃取瓶、碳柱、鋼珠和酸性硅膠),SP2-STSP2-RT試劑盒(含活塞),DF1-60試劑盒5.1225mL容量瓶5.13連續(xù)移液器(100μL-2mL),微量移液器(0-10μL,0-100μL)。5.14帶有聚四氟乙烯樹脂內(nèi)襯蓋子的玻璃小瓶(2-12mL)。5.15玻璃試管(15-20mL)5.17過濾篩(200目)6儀器設(shè)備6.1電子天平(百分之一)6.2平板軌道振蕩器(可做橢圓旋轉(zhuǎn))6.3離心機6.4氮氣吹干儀6.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀6.6索氏提取器6.7分光光度計(波長450nm)試劑盒(含硅膠柱和空柱),丁7樣品采集土壤采集按HJ/T166-2004《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》中采樣的規(guī)定方法實施。沉積物采集按HJ494-2009《水質(zhì)采樣技術(shù)指導》中采樣的規(guī)定方法實施。固體廢物采集按HJ/T20-1998《工業(yè)固體廢物采樣制樣技術(shù)規(guī)范》中采樣的規(guī)定方法實施。采集后的土壤、沉積物和固體樣品在實驗室中風干、磨碎、過篩，保存在棕色玻璃瓶中，貯存于2-6℃環(huán)境中。樣品采集后，40天內(nèi)應(yīng)完成提取。8樣品前處理8.1土壤和沉積物樣品8.1.1所有與實驗相關(guān)的玻璃器皿，都要預(yù)先用甲苯清洗，干燥?？瞻字灯邥r，可考慮使用馬弗爐48.1.2樣品實驗前應(yīng)進行風干、磨碎和過篩(200目過濾篩)處理。8.1.3樣品混勻后稱取5.00g加入到40mL萃取瓶(SP3-60試劑盒)中(每個瓶子寫好標簽)。8.1.4每個萃取瓶中加入5g酸洗石英砂、10-20g無水硫酸鈉，再加入3顆鋼珠(在此步添加2,3,7,8-TCDD于方法空白和樣品中，通過篩查結(jié)果計算方法空白和樣品的加標回收率)。8.1.5每個萃取瓶中加入20mL正己烷和丙酮混合溶液(體積比1:1),擰緊瓶蓋，將萃取瓶放入平板軌道振蕩器中進行橢圓震蕩4小時，振動頻率為180-200次/分。此步同時計算正己烷和丙酮混合溶液 (體積比1:1)的密度。8.1.6震蕩完畢后取出萃取瓶靜置6-8小時，用吸量管將萃取瓶中上清液全部轉(zhuǎn)移到已標記的玻璃試管中(玻璃試管事先稱重),轉(zhuǎn)移完成后對玻璃試管進行稱重，記錄所轉(zhuǎn)移上清液的質(zhì)量。再根據(jù)記錄的上清液的質(zhì)量計算所轉(zhuǎn)移上清液的體積。8.1.7每個玻璃試管中加入0.25mL正十四烷，將每個玻璃試管置于氮氣吹干儀中在40℃水溫下進行氮吹，至丙酮溶液完全清除。8.1.8氮吹完畢后每個玻璃試管中加入5mL正己烷，若玻璃試管中溶液顏色較深則應(yīng)加入1-2g酸性硅膠(SP3-60試劑盒)處理，待溶液澄清。8.1.9預(yù)洗柱：硅膠柱(SP2-ST)中加入10mL正己烷，正己烷從柱子底端滴下，從SP3-60試劑盒中取出碳柱，加入正己烷在碳柱的平口端，將其平口端接到硅膠柱的底端并擰緊，硅膠柱與碳柱連接處不允許氣泡產(chǎn)生。同時硅膠柱中正己烷應(yīng)覆蓋硅膠(每根硅膠柱做好標記)。8.1.10預(yù)洗后的硅膠柱中加入8.1.8步驟中玻璃試管中溶液進行過柱，分2次每次用2mL正己烷潤洗玻璃試管，潤洗液全部加入已標記的硅膠柱中，以保證所有的溶液全部轉(zhuǎn)入硅膠柱中，進行加壓過柱，至溶液液面略高于硅膠上表面時停止加壓。8.1.11_分2次過柱，每次加入15mL正己烷到硅膠柱中過柱。第二次過柱時溶劑距離碳柱頂部1-2cm時停止加壓(保持碳柱的濕潤狀態(tài))。8.1.12從硅膠柱上取下碳柱，將其平口端連接到空柱(SP2-ST試劑盒)底部，加入6mL甲苯和正己烷混合溶液(1:1)到空柱中進行加壓過柱，待溶液流至碳柱頂部時停止加壓(保持碳柱濕潤狀態(tài))(空柱做好標記)。8.1.13從空柱上取下碳柱，將其斜口端接到同一根空柱上，加入12mL甲苯加壓過柱進行洗脫，洗脫液接收在玻璃試管中，甲苯完全流過碳柱，直至不再有液體滴下為止(玻璃試管作好標記)。8.1.14根據(jù)實驗樣品情況選擇蒸發(fā)模式(見附錄B),在玻璃試管中加入保留劑(DF1-60試劑盒)(以附錄B中B模式為例，B模式下加入量為62.5μL),在70℃水溫下進行氮吹，至甲苯全部清除。8.1.15氮吹完畢后取出試管，放置于離心機中在1500-2000轉(zhuǎn)每分鐘轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，將所有樣品溶液富集在試管底部。8.2固體廢物樣品8.2.1所有與實驗相關(guān)的玻璃器皿，都要預(yù)先用甲苯清洗，干燥?？瞻字灯邥r，可考慮使用馬弗爐對所有儀器進行烘干，降低空白值。8.2.2潤洗索氏提取器，接250mL甲苯到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的圓底燒瓶中進行索氏提取，潤洗約2小時。8.2.3樣品實驗前應(yīng)進行風干、磨碎和過篩(200目過濾篩)處理。58.2.4樣品混勻后稱取0.25g用2mol/L鹽酸處理1小時。鹽酸的用量為每1g樣品加不少于20mmol鹽酸，使其與鹽酸充分接觸并觀察發(fā)泡情況，必要時再添加鹽酸，直至不再發(fā)泡為止。過濾干燥后用玻璃纖維包好，加入到潤洗后的圓底燒瓶中。過濾后的鹽酸處理液用100mL二氯甲烷萃取三次。8.2.5在8.2.4步圓底燒瓶中加入250mL甲苯用索氏提取器進行索氏提取，提取16-20小時(在此步添加2,3,7,8-TCDD于方法空白和樣品中，通過篩查結(jié)果計算方法空白和樣品的加標回收率)。8.2.6提取完畢后，將圓底燒瓶中的甲苯提取液和8.2.4步驟中的二氯甲烷萃取液合并加入到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的梨形瓶中，圓底燒瓶和萃取瓶用少量甲苯各潤洗2次后轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，保證樣品溶液全部轉(zhuǎn)入梨形瓶中。8.2.7樣品溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行蒸發(fā)，水浴溫度設(shè)置80℃,真空泵壓力調(diào)整至0.08MPa,蒸發(fā)至剩余溶液體積為2-3mL后停止，用吸量管將溶液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用少量正己烷潤洗梨形瓶2-3次以保證樣品全部轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后用正己烷定溶，搖勻。8.2.8預(yù)洗柱：硅膠柱(SP2-ST)中加入10mL正己烷，正己烷從柱子底端滴下，從SP3-60試劑盒中取出碳柱，在碳柱的平口端加入正己烷，將其平口端接到硅膠柱的底端并擰緊，硅膠柱與碳柱連接處不能產(chǎn)生氣泡。同時硅膠柱中正己烷應(yīng)覆蓋硅膠(每根硅膠柱做好標記)。8.2.9用移液器從8.2.7步驟定溶后的容量瓶中移取樣品溶液3.0mL加入到預(yù)洗后的硅膠柱中，進行加壓過柱。8.2.10分2次過柱，每次加入15mL正己烷到硅膠柱中過柱，第二次過柱時當溶劑距離碳柱頂部1-2cm時停止加壓(保持碳柱的濕潤狀態(tài))。8.2.11從硅膠柱上取下碳柱，將其平口端接到空柱(SP2-ST試劑盒)底部，加入6mL甲苯和正已烷混合溶液(體積比1:1)到空柱中進行加壓過柱，待溶液流至碳柱頂部時停止加壓(保持碳柱濕潤狀態(tài))(空柱做好標記)。8.2.12從空柱上取下碳柱，將其斜口端連接到同一根空柱上，加入12mL甲苯加壓過柱進行洗脫，洗脫液接收在玻璃試管中，甲苯完全流過碳柱，直到不再有液體滴下為止(玻璃試管作好標記)。8.2.13根據(jù)實驗樣品情況選擇蒸發(fā)模式(以附錄B中B模式為例),在玻璃試管中加入保留劑(B模式下加入量為62.5μL)(DF1-60試劑盒),在70℃水溫下進行氮吹，至甲苯溶液全部清除。8.2.14氮吹完畢后取出試管，放置于離心機中在1500-2000轉(zhuǎn)每分鐘轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，將所有樣品溶液富集在試管底部。9酶聯(lián)免疫分析9.1將DF1-60試劑盒內(nèi)所有試劑回溫至20-26℃才可使用。使用前，將所有溶劑輕輕地倒置混勻。9.2清洗劑配制：從DF1-60試劑盒中取出標有“0.5mLneatTritonX-100”的玻璃瓶。用微量移液器移取10μL的TritonX-100直接加入到100mL去離子水中混勻，制作出濃度為0.01%V/V的清洗劑。9.3從DF1-60試劑盒中取出酶聯(lián)免疫測定管，編號排列后用去離子水清洗每個測定管，重復清洗3次，倒去去離子水并反置，拍干。9.4將標準品系列溶液按低濃度到高濃度依次排列，混勻后靜置待用。9.5每個酶聯(lián)免疫測定管中加入500μL樣品稀釋液(DF1-60試劑盒)。9.6添加標準品(2,3,7,8-TCDD標準品):用微量移液器移取50μL標準品加入到已標記的酶聯(lián)免疫6測定管中，標準品必須用移液器從液面以下加入到溶液中，不能在液體上部懸空加入到溶液中，加入后搖勻(注意標準品的添加，應(yīng)是從低濃度到高濃度)。9.7根據(jù)蒸發(fā)模式要求，8.1.15和8.2.14步驟中離心后的每個玻璃試管中加入甲醇(B模式下加入量為50μL)到試管底部，震蕩，混勻15秒后讓試管保持垂直15-30秒，保證液體富集在試管底部，立即進行下一步實驗操作。9.8加入待測樣品：用微量移液器在玻璃試管中移取50μL樣品溶液加入到已標記的酶聯(lián)免疫測定管中。樣品溶液必須用移液器從液面以下加入到溶液中，不能在液體上部懸空加入到溶液中。加入后立即搖勻樣品，在20-26℃溫度下孵育12到24個小時。9.9第一次孵育完成后，清洗全部的酶聯(lián)免疫測定管，用9.2步驟配制好的清洗劑進行清洗，每次1mL,重復清洗4次。清洗完畢后倒置除去測定管中水分，然后加入HRP(辣根過氧化物酶)(DF1-60試劑盒)進行第二次孵育，時間為15分鐘。孵育完成后用去離子水進行清洗，每次1mL,重復清洗4次。清洗完畢后倒置除去測定管中水分，然后加入HRP底物(DF1-60試劑盒)進行第三次孵育，時間為30分鐘。孵育完成后加入終止液1mol/L鹽酸溶液(DF1-60試劑盒)。9.10使用分光光度計(450nm波長),加入不少于1mL去離子水到空白酶聯(lián)免疫測定管并置于光度計上對光度計進行校正。擦干每個酶聯(lián)免疫測定管的外表面并放置于光度計上測定每個測定管的吸光度值。10標準曲線繪制將2,3,7,8-TCDD用甲醇配制成0、3.2、10、32和100pg/管(每個酶聯(lián)免疫測定管中標準品的添加量均為50μL)的系列標準工作溶液(見附錄C),分別進行酶聯(lián)免疫分析，測得各濃度所對應(yīng)的吸光度值。根據(jù)式(1)作2,3,7,8-TCDD的劑量-效應(yīng)關(guān)系標準曲線。如圖2所示，標準曲線為倒“S”型。Y=((A-D)/(1+(X/C)))+DX=pg/tube(2,3,7,8-TCDD標準品的毒性當量值)Y=每個酶聯(lián)免疫測定管所測得的吸光度值與0濃度測得的吸光度值的百分比A:0濃度時對應(yīng)的Y值B:曲線部分的斜度C:Y值為50時對應(yīng)的X值D:較低漸近線的Y值711結(jié)果計算利用分光光度計測定二惡英類樣品時得到的吸光度值M,測定0濃度時得到的吸光度值N,計算出吸光度值的相對值Y。再通過上述的標準曲線求得衍生物換算濃度TEQ(pg/管)即X(pg/管)。按操作步驟進行酶聯(lián)免疫檢測，加待測樣品a(g)加入到酶聯(lián)免疫測試管中，將相應(yīng)數(shù)據(jù)代入公式(1)~(3),計算出每單位樣品重量中的毒性當量。12.2精密度同一樣品重復測定相對標準偏差(RSD)變化范圍為5-70%。12.3準確度方法空白加標回收率變化范圍為70-130%。方法樣品加標回收率變化范圍為60-135%。813質(zhì)量保證和質(zhì)量控制13.1標準曲線質(zhì)量控制情況二惡英類篩查所有批次的實驗所得到的2,3,7,8-TCDD校準標準測定值應(yīng)在標準曲線質(zhì)量控制范圍內(nèi)，實驗所得到的標準曲線方為合格。標準曲線質(zhì)量控制情況見附錄D。13.2分析質(zhì)量保證最基本的要求13.2.1應(yīng)用方法空白來證明系統(tǒng)未被污染，空白值變化范圍應(yīng)在3.0-8.0ngI-TEQ/kg之間。13.2.2實驗室應(yīng)每批次考察校正結(jié)果、精密度和回收率一次，以確認分析系統(tǒng)處于正常狀態(tài)。13.3樣品中標記化合物的回收率需要按期評價并做好記錄，每30天對各種基質(zhì)樣品進行平行樣分析(不少于五個),計算出標記化合物的平均回收率(R)和回收率標準偏差(SR)。13.4空白實驗空白實驗分為兩種：試劑空白和操作空白。試劑空白用來檢查分析儀器的污染情況；操作空白用來檢查樣品制備過程的污染程度。13.4.1試劑空白：所有試劑空白測試結(jié)果應(yīng)低于方法檢出限。13.4.2操作空白：為評價實驗環(huán)境的污染干擾水平，應(yīng)進行操作空白實驗。除不添加實際樣品外，操作空白試驗的樣品制備、前處理、儀器分析和數(shù)據(jù)處理步驟與實際樣品分析步驟相同，結(jié)果應(yīng)低于評價濃度的1/10。在樣品制備過程有重大變化時(如使用新的試劑或儀器設(shè)備，或者儀器維修后再次使用時)或樣品間可能存在交叉污染時(如高濃度樣品)應(yīng)進行操作空白的分析。13.5標準溶液：標準溶液應(yīng)裝在密封的玻璃容器中避光冷藏保存。13.6質(zhì)量控制考察樣品：每批次實驗分析質(zhì)量控