艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程人類免疫缺陷病毒抗體檢測（酶聯(lián)免疫法）科華生物操作方法：將試劑盒平衡至室溫，取出所需的條板，剩余的即時(shí)封存。用去離子水合蒸餾水25倍稀釋濃縮洗滌液。將所需數(shù)量的條板固定于支架按順序編號(hào)設(shè)置樣品孔、外部對照孔、陽性對照孔和陰性對照孔每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)外部對照陽性對照2孔、陰性對照1孔。在樣品孔中加入100ul待測樣品，陰性、陽性對照及外部對照每孔加入100ul，輕拍混勻。置37℃溫育60分鐘。置洗板機(jī)用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。每孔加入100ul酶標(biāo)記物，輕拍混勻，置37℃溫育30分鐘。重復(fù)步驟⑥。在所有孔內(nèi)加顯色A、顯色B劑各50ul，輕拍混勻，置37℃避光溫育30分鐘。每孔加入50ul終止液終止顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀（雙波長450nm/630nm）測定各孔A值。結(jié)果判定：臨界值Cutoff＝0.1﹢陰性對照的平均A值（陰性對照的平均A值小于0.08按0.08計(jì)算，大于0.08按實(shí)際值計(jì)算），樣品的A值≥Cutoff值為艾滋病抗體陽性；樣品的A值〈Cutoff值為艾滋病抗體陰性。同時(shí)滿足以下條件的實(shí)驗(yàn)是有效的。NC<0.080PCx>0.8，抗-艾滋病-2陽性對照OD值>0.3雙波長讀數(shù)，顯色劑空白≦0.040，單波長讀數(shù)，顯色劑空白≦0.080.計(jì)算COV：COV=PCxX10%（若PCx>2.5按2.5計(jì)算）初篩陽性者應(yīng)重新取樣進(jìn)行雙盲復(fù)試，復(fù)試陽性者應(yīng)按照“全國艾滋病檢測管理規(guī)范”送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)確認(rèn)試驗(yàn)。

萬泰生物操作方法：配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔板按序號(hào)編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔，陽性對照1型，2型各1孔，空白對照1孔。（用雙波長檢測，可不設(shè)空白對照孔）。加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品或陰性，陽性對照100ul.溫育：用封板膜封板后，置37±1℃溫育60±2分鐘。洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量擰干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100ul，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后，置37±1℃溫育30±1分鐘。洗板：操作同步驟5.顯色：每孔加入顯色劑A，B液各50ul，輕輕振蕩混勻，37±1℃避光顯色30±1分鐘。測定：每孔加終止液50ul，輕輕振蕩混勻，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm處（建議用雙波長450nm/600-650nm），用空白孔凋零后測定各孔A值。結(jié)果判讀：陰性對照孔A值≤0.10，陽性對照孔A值≥0.80，否則實(shí)驗(yàn)無效。若有1孔陰性對照A值大于0.1應(yīng)舍棄；若兩孔或兩孔以上陰性對照A值大于0.1，實(shí)驗(yàn)無效。陰性判定：樣品A值＜臨界值（CUTOFF）者為艾滋病抗體陰性。陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTFF）者為艾滋病抗體陽性（注意：初試陽性應(yīng)重新取樣雙孔復(fù)試。復(fù)試陽性者按《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》送艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。）

丙型肝炎病毒抗體檢測（酶聯(lián)免疫法）操作步驟：配液：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔（空白對照孔只加稀釋液不加樣品及酶標(biāo)試劑）其余各孔加入100UL樣本稀釋液。加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品，陰，陽對照10微升，輕輕振蕩混勻。溫育：用封版膜封版后，置37oc溫育60分鐘。洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量擰干。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶標(biāo)記抗體100微升，輕輕振蕩混勻。溫育：置37oc溫育30分鐘。洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量擰干顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振勻，37oc避光顯色30分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），輕輕振蕩混勻。測定：10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設(shè)定酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450nm/600-650nm測定。用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測定各孔A值。結(jié)果判斷臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：CUT/OFF=陰性對照孔A均值+0.12。（不足0.02按0.02計(jì)算）陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF）者判定為抗HCV陽性。（注意初試陽性應(yīng)重新取樣雙孔復(fù)試）陰性判定：樣品A值〈臨界值（CUTOFF）者判定為抗HCV陰性。

梅毒螺旋體抗體（酶聯(lián)免疫法）操作步驟：配液：濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔（用雙波長檢測，可不設(shè)空白對照孔）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品，陰，陽對照100微升，輕輕振蕩混勻。溫育：用封版膜封版后，置37oc溫育60分鐘。洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量擰干。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶標(biāo)記抗體100微升，輕輕振蕩混勻。溫育：用封版膜封板后，置37oc溫育30分鐘。洗滌：揭掉封版膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量擰干顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振勻，37oc避光顯色30分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），輕輕振蕩混勻。測定：10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm（建議雙波長450nm/600-650nm測定）用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測定各孔A值。結(jié)果判斷臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對照孔A均值+0.18。陽性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF）者判定為TP陽性。（注意：初試陽性應(yīng)重新取樣雙孔復(fù)試）陰性判定：樣品A值〈臨界值（CUTOFF）者判定為TP陰性。

乙肝五項(xiàng)操作規(guī)程乙型肝炎表面抗原（HBsAg）操作步驟：配液：配制工作濃度洗滌液（以純化水做25倍稀釋）編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)（共預(yù)留陰性對照孔3孔、陽性對照1孔、建議預(yù)留空白對照1孔）加樣：加入75微升待測樣本和陰、陽性對照與反應(yīng)孔中。溫育：用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，置37oc溫育60分鐘。加酶標(biāo)抗體：取出反應(yīng)板，撕去封片，在已加入待測樣本和陰性、陽性對照孔中加入50微升酶結(jié)合物。微孔振蕩器或手工輕輕振蕩10秒鐘。溫育：用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，置37oc溫育30分鐘。洗滌：手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復(fù)5次在吸水紙上拍干。洗板機(jī)：將孔內(nèi)液體甩干。選擇5次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振蕩勻，用封板紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板放置37oc孵化30分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。測定：用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長450nm。（建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm或630相近的波長）若需扣除顯色劑空白，則先用顯色劑空白對照孔校零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陰性。酶標(biāo)儀檢測：臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：COV:Cut-offValue參考值PC：陽性對照OD值NCx：陰性對照平均OD值。NCx=(NC1+NC2+NC3)÷3檢測有效性：NCx≤0.1、PC≥1.0，則檢測結(jié)果有效。COV=NCx+0.100S：待測樣品的OD值，S/COV：待測樣本和COV的比值。陽性判定：樣品OD值S/COV≥1.0者判定為HBsAg陽性。陰性判定：樣品OD值S/COV<1.0者判定為HBsAg陰性。

乙型肝炎表面抗體（抗-HBs）、操作步驟：配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應(yīng)充分溶解），將濃縮洗滌液（20*）用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋后使用。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。溫育：置37oc溫育30分鐘。洗滌：手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，扣去洗滌液，重復(fù)5次在吸水紙上拍干。洗板機(jī)：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振勻，37oc避光顯色15分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。測定：用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷目測：在白色背景下觀察核孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗體（抗－HBs）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗體（抗－HBs）陰性。酶標(biāo)儀檢測：臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：COV=陰性對照平均OD值×2.1。（陰性對照孔OD值低于0.05者按0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。陽性判定：樣品的OD值大于或等于COV值時(shí)，說明HBsAg陽性。陰性判定：樣品OD值小于COV值時(shí)，說明為HBsAg陰性。

乙型肝炎核心抗體（抗-HBc）操作步驟：配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應(yīng)充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋后使用。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）加樣：將待測樣本用生理鹽水1:30稀釋。（稀釋樣本檢測結(jié)果為臨床意義；樣本原液加樣，檢測結(jié)果為流行病學(xué)意義。用戶可根據(jù)實(shí)際情況選擇。）分別在相應(yīng)孔中加入稀釋樣本50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。溫育：置37oc溫育30分鐘。洗滌：手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復(fù)5次在吸水紙上拍干。洗板機(jī)：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振勻，37oc避光顯色15分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。測定：用于酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷目測：在白色背景下觀察核孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎表面抗體（HBcAb）陽性；無色者為乙型肝炎表面抗體（HBcAb）陰性。酶標(biāo)儀檢測：臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：未稀釋樣品CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×0.3。1:30稀釋樣品CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×0.5。陽性判定：樣品OD值小于COV，說明該樣品HBcAb陽性。陰性判定：樣品OD值大于或等于COV，說明該樣品HBcAb陰性。

乙型肝炎e抗原（HBeAg）操作步驟：配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應(yīng)充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋后使用。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。溫育：置37oc溫育30分鐘。洗滌：手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置浸泡30～60秒，扣去洗滌液，重復(fù)5次在吸水紙上拍干。洗板機(jī)：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升），輕輕振勻，37oc避光顯色15分鐘。終止：每孔加終止液1滴（50微升），混勻。測定：用于酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm（建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm）測定各孔OD值先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷目測：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯黃色者為乙型肝炎e抗原（HBeAg）陽性；無色者為乙型肝炎e抗原（HBeAg）陰性。酶標(biāo)儀檢測：臨界值（CUT/OFF）計(jì)算：CUT/OFF=陰性對照孔OD均值N×2.1。（陰性對照孔OD值低于0.05者按0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算）陽性判定：樣品OD值大于或等于COV值時(shí)，說明該樣品HBeAg陽性。陰性判定：樣品OD值小于COV值時(shí)，說明該樣品HBeAg陰性。

乙型肝炎e抗體（抗-HBe）操作步驟：配液：濃縮洗滌液配置前充分混勻（如有結(jié)晶析出應(yīng)充分溶解），將濃縮洗滌液（25*）用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋后使用。編號(hào)：將樣品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰陽性對照各2孔和空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品50微升和陰，陽對照50微升及質(zhì)控血清。加酶標(biāo)抗體：空白對照孔不加酶標(biāo)試劑，每孔加入酶結(jié)合物50微升，輕輕振蕩混勻。溫育：置37oc溫育30分鐘。洗滌：手工：扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復(fù)5次在吸水紙上拍干。洗板機(jī)：將孔內(nèi)液體甩干。選擇4次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加入顯色劑A，B液各1滴（50微升