病原生物與免疫學基礎（第5版）課件 第十四章 病原生物學實訓項目

病原生物學實訓項目

1．熟悉顯微鏡的結構、功能和使用方法

2．掌握細菌的基本形態(tài)和特殊結構

3．掌握細菌生長現象

4．初步學會細菌接種法及無菌操作

5．驗證微生物在自然界的分布

6．了解細菌涂片標本的制作與革蘭染色實驗目的1.微生物實驗室規(guī)則介紹

2.顯微鏡的使用及保護方法

3.細菌形態(tài)觀察（基本形態(tài)觀察、特殊結構觀察、革蘭染色示教培養(yǎng)基的制備過程）

4.常用培養(yǎng)基介紹

5.細菌的接種法及無菌操作

6.細菌在培養(yǎng)基中生長現象觀察

7.細菌的分布檢查實驗內容1．進入實驗室前必須穿好白大衣，離室后脫下、反折。必要時配戴口罩。白大衣要勤洗換。

2．書包和衣物等不得帶入實驗室，必要的用具放在指定的位置。

3．實驗室內嚴禁吸煙、飲食，以免感染。

4．保持實驗室內安靜，不得高聲談笑或隨便走動，以利集中精力完成實驗操作。

5．實驗操作時，若不慎將傳染標本、菌液等污染桌面，污染衣物、書本、手指及地面等意外事故，應立即報告帶教老師，及時作出處理。微生物實驗室規(guī)則介紹6．用過的吸管、滴管、試管和玻片等應放在指定的污物缸或盛有消毒液的搪瓷缸內，不得放在桌面上或水槽內，不得隨便沖洗。

7．正確使用實驗儀器，不得隨意撥動電器開關等；節(jié)約實驗材料，如損傷儀器或器材，應及時報告帶教老師進行登記。

8．實驗完畢后清理桌面，將需要培養(yǎng)的物品放入指定的培養(yǎng)箱或溫室中。顯微鏡要擦干凈后方可歸還顯微鏡室，用過物品歸還原處，并清潔和消毒桌面；洗手離開實驗室，值日生要認真清掃實驗室，關閉門、窗、水、電后方可離開實驗室。微生物實驗室規(guī)則介紹顯微鏡的使用及保護方法目鏡物鏡光源載物臺載物臺調節(jié)器細調節(jié)器粗調節(jié)器開關1、將顯微鏡放置在平整干凈的實驗臺面上，鏡座距離試驗臺面邊緣3-4cm。

2、調節(jié)粗調節(jié)器，上旋載物臺至最高，低倍鏡觀察，邊觀察邊下旋，找到理想視野范圍，在標本欲檢部位滴1滴香柏油，然后轉換成油鏡。從側面觀察，緩慢轉動粗調節(jié)器，使油鏡頭浸沒在油滴內，當油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉動，用肉眼觀察接目鏡，緩慢調節(jié)粗調節(jié)器，使鏡筒上升（只能上升，不能下降，以防壓碎標本片和損壞油鏡），待看到模糊物像時，再調節(jié)細調節(jié)器，直至清晰看到細菌等微生物形態(tài)。

顯微鏡的使用及保護方法（1）顯微鏡是精密的光學儀器，使用時應注意愛護，各部分結構不得隨意拆卸，以免損壞。

（2）取送搬移顯微鏡時，要一手持鏡臂，一手托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。

（3）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用后應立即用擦鏡紙拭去鏡油。若油鏡頭上的油跡未擦干凈，應先將二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。

（4）顯微鏡擦凈后，接物鏡轉成“八”字形并降低，下降聚光器，送至顯微鏡室，對號入座。顯微鏡的使用及保護方法細菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

球菌

葡萄球菌（G+球形、堆積狀排列）鏈球菌（G+球菌、鏈狀排列）細菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

球菌

肺炎雙球菌（G+球菌）腦膜炎奈瑟菌（G-球菌）細菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

桿菌、弧菌

大腸埃希菌（G-桿菌）

水弧菌（G-弧菌）

細菌形態(tài)觀察特殊結構

芽孢

破傷風梭菌（芽孢位于頂端）

細菌形態(tài)觀察

特殊結構

鞭毛

傷寒桿菌（周鞭毛）

細菌形態(tài)觀察特殊結構

莢膜

產氣莢膜梭菌（負染法）

革蘭染色原理革蘭染色的原理目前存在三種假說：1．通透性學說

革蘭陽性菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層厚，脂質含量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細胞壁結構疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質，乙醇易滲入。2．等電點學說

革蘭陽性菌等電點（pI2-3）比革蘭陰性菌（pI

4-5）低，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結晶紫染料結合牢固，不易脫色。3．化學學說

革蘭陽性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結晶紫牢固結合，使已著色的細菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。草酸銨結晶紫初染1min95%乙醇脫色0.5min碘液媒染1min稀釋石炭酸復紅復染0.5min涂片干燥固定鏡檢制片脫色媒染初染復染

革蘭染色操作鏡檢1、鑒別細菌；2、診斷疾??；3、選擇用藥。革蘭染色結果：G+菌為紫色；G-菌為紅色。革蘭染色臨床意義：

革蘭染色結果、臨床意義1．操作因素涂片太厚或太薄，固定時菌體過分受熱，以及脫色時間長短，都會影響染色結果。2．染色因素所有染液應防止染液蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片積水過多會改變染液濃度，影響染色效果，如脫色用的乙醇以95%為宜，濃度降低會增強其脫色能力。3．細菌因素細菌的菌齡不同，革蘭染色結果也有差異，一般以18-24h的培養(yǎng)物染色效果最好，菌齡過長影響細菌染色性。

革蘭染色結果影響因素準確稱量－混合溶解－矯正pH值－分裝－滅菌－檢定－保存培養(yǎng)基的制備過程常用培養(yǎng)基·半固體培養(yǎng)基含0.5%凝固劑（瓊脂）·各類液體培養(yǎng)基不含凝固劑（瓊脂）·各類固體培養(yǎng)基含2%-3%凝固劑（瓊脂）的培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基各類液體培養(yǎng)基接種環(huán)液體培養(yǎng)基的接種·接種法：液體培養(yǎng)基

·生長現象：表面生長渾濁生長沉淀生長液體培養(yǎng)基中細菌生長現象接種針半固體培養(yǎng)基·接種法：·生長現象：擴散生長無擴散生長

動力陽性動力陰性半固體培養(yǎng)基穿刺接種法固體培養(yǎng)基·平板接種法：平行劃線法液體培養(yǎng)基中細菌生長現象固體培養(yǎng)基·平板接種法：四區(qū)分離劃線1區(qū)2區(qū)3區(qū)4區(qū)菌苔菌落常用培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基·斜面接種法：羽毛狀生長1.接種環(huán)伸入到斜面底部向上劃線2.接種環(huán)再伸入到底部“之”字形向上劃線細菌的分布檢查1.空氣中的細菌檢查根據空間特點計算采樣點布置布置采樣皿開蓋采樣一定時間恒溫培養(yǎng)結果計算細菌的分布檢查2.水中的細菌檢查水樣做一定稀釋后注入平皿中，恒溫培養(yǎng)清點菌落形成單位，計算后，