DB32-T 4394-2022 梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)技術(shù)規(guī)程

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T4394—2022梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Codeofpracticeformonitoringanddetectionofpearfireblight江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局ⅠDB32/T4394—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省園藝標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站。1DB32/T4394—2022梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的原理、監(jiān)測(cè)植物、設(shè)備與試劑、病害監(jiān)測(cè)、病菌檢測(cè)、結(jié)果判定和報(bào)告、樣品和菌株保存及無害化處理等。本文件適用于梨火疫病監(jiān)測(cè)與病菌檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB15569農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程GB/T36852亞洲梨火疫病菌檢疫鑒定方法DB32/T3788梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。梨火疫病，病原為解淀粉歐文氏菌[Erwiniaamylovora(Burrill,1883)Winslowetal.,1920],是危害梨、蘋果、杜梨、山楂、海棠、韞悖等薔薇科植物的檢疫性有害生物。根據(jù)梨火疫病田間癥狀、病菌生物學(xué)特征、致病特性、免疫學(xué)和分子生物學(xué)反應(yīng)特征等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和檢測(cè)。5監(jiān)測(cè)植物梨和蘋果。6設(shè)備與試劑鍋、培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、體視顯微鏡、低溫高速離心機(jī)、電泳儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀、凝膠成像系6.2試劑與材料監(jiān)測(cè)與檢測(cè)過程中所有試劑、溶液及培養(yǎng)基配方，參見附錄A。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析2DB32/T4394—2022純或生化試劑。7病害監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)梨、蘋果集中種植區(qū)。對(duì)疫情發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)的果園、苗圃和采穗圃，以及從發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)調(diào)入的苗木、砧木、接穗和花粉等進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。每年4月~7月，重點(diǎn)在梨樹、蘋果樹開花期到果實(shí)膨大中期進(jìn)行監(jiān)測(cè)調(diào)查，尤其是在雨后或澆水后。向當(dāng)?shù)刂脖T、農(nóng)技員、果農(nóng)、種苗和農(nóng)藥經(jīng)銷商等相關(guān)人員詢問梨樹和蘋果樹果園、苗圃和采穗圃是否有梨火疫病疑似癥狀（見附錄B)及其發(fā)生地點(diǎn)、時(shí)間、危害情況等信息，判斷是否存在可疑發(fā)生區(qū)。每年在花期和幼果期各調(diào)查1次。對(duì)訪問調(diào)查發(fā)現(xiàn)的可疑發(fā)生區(qū)和其他有代表性的果園、苗圃和采穗圃進(jìn)行踏查，觀察田間是否有梨火疫病典型癥狀（見附錄B)。如發(fā)現(xiàn)典型或可疑癥狀的病株，立刻進(jìn)行標(biāo)記和拍照，取樣后送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。每年在花期和幼果期各踏查1次。在踏查確認(rèn)的發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，選擇有代表性的果園、苗圃和采穗圃進(jìn)行定點(diǎn)調(diào)查，每15d調(diào)查1次。面積小于50畝的設(shè)置1個(gè)調(diào)查樣地，面積每增加50畝增設(shè)1個(gè)調(diào)查樣地，樣地面積不小于5畝。在樣地內(nèi)采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查不少于20株，調(diào)查并統(tǒng)計(jì)病株率。按照附錄C要求記錄相關(guān)信息，并將病樣送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。對(duì)來自疫情發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的種苗、砧木、接穗按GB15569要求進(jìn)行抽樣檢查，對(duì)病樣或疑似病樣送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)鑒定；對(duì)無癥狀樣品，至少隨機(jī)選取5份送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。按GB15569要求進(jìn)行抽樣，并送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。3DB32/T4394—20228病菌檢測(cè)按照GB/T36852要求執(zhí)行。先用75%乙醇對(duì)樣品表面進(jìn)行消毒，晾干，然后從每個(gè)無癥種苗、接穗、砧木隨機(jī)切取新生樹皮（包含維管束部分）2塊~3塊，每塊約20mm2,加入到裝有2mL~3mL無菌水的無菌離心管中浸泡30min,制備樣品浸出液。每份花粉樣品取0.1g,加入到裝有1mL~2mL無菌水的無菌離心管中浸泡30min,制備樣品浸出液。8.2顯微鏡檢查按照DB32/T3788要求執(zhí)行。8.3生物學(xué)特征觀察將樣品浸出液在NA培養(yǎng)基平板上劃線或梯度稀釋分離，28℃培養(yǎng)24h~48h。挑取單菌落在NA培養(yǎng)基上進(jìn)一步劃線純化2次~3次，獲得觀察記錄菌落形態(tài)和其他特征，也可用透射電鏡觀察菌體形態(tài)、大小、有無鞭毛及鞭毛著生的位置和數(shù)目等（參見附錄B)。8.4致病性測(cè)定將純化的分離物接種幼果，24h~48h后觀察接種部位有無壞死和菌膿產(chǎn)生；或接種嫩梢48h~96h后，觀察接種點(diǎn)是否出現(xiàn)變黑、組織干癟、枝梢萎蔫、菌膿溢出等癥狀。8.5ELISA檢測(cè)取樣品浸出液或用純化的分離物配制成的菌懸液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)檢測(cè)，檢測(cè)程序參見附錄D。如采用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)，按照說明書操作并進(jìn)行結(jié)果判定。8.6PCR檢測(cè)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，可選擇PCR凝膠電泳檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)程序按照附錄E。9結(jié)果判定和報(bào)告田間梨樹和蘋果樹發(fā)病癥狀符合附錄B描述的典型癥狀，初步判斷為梨火疫病并送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。4DB32/T4394—2022鏡檢有溢菌現(xiàn)象；分離物生物學(xué)特征與梨火疫病菌相符（參見附錄B);分離物在幼果或嫩梢上的致病性測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性，且能再次從接種發(fā)病部位分離獲得相同的分離物，判定分離物為引起梨火疫病的病原菌即梨火疫病菌。9.1.3ELISA檢測(cè)結(jié)果判定在陰性對(duì)照OD值小于或等于0.1,且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于或等于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，檢測(cè)樣品OD值大于或等于陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即從樣品中檢出梨火疫病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即從樣品中未檢出梨火疫病菌。9.1.4PCR檢測(cè)結(jié)果判定PCR檢測(cè)結(jié)果按照附錄E判定。按照附錄C填寫監(jiān)測(cè)結(jié)果，整理匯總后形成監(jiān)測(cè)報(bào)告。按照附錄F填寫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定結(jié)果，形成檢測(cè)鑒定報(bào)告。10樣品和菌株保存及無害化處理4℃下保存，以備復(fù)核。保存樣品要標(biāo)明編號(hào)、名稱、來源、保存人、保存日期和到期日期。樣品保存期滿后，應(yīng)滅活銷毀處理。分離并鑒定為梨火疫病菌的菌株可采用甘油低溫保存或凍干保存。監(jiān)測(cè)和檢測(cè)過程中使用過的有關(guān)材料、用具、不需要長(zhǎng)期保存的菌液、分離菌株等，在使用完畢和試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行滅活銷毀處理。5DB32/T4394—2022附錄A（資料性）試劑及培養(yǎng)基配制方法A.1ELISA檢測(cè)PO4PO4脫脂奶粉5g,溶解于100mL樣品提取液。脫脂奶粉2.5g,溶解于100mL洗滌液。A.1.6TMB顯色液10mgTMB溶于1mL二甲亞砜(DMSO)中，4℃保存。O2O2用超純水定容到1mL,4℃避光保存。在10mL底物緩沖液加入100μLTMB母液和32μL0.75%H2O2混勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。濃硫酸11.1mL,用蒸餾水定容到100mL。6DB32/T4394—2022A.2PCR檢測(cè)A.2.1電泳緩沖液TBE在1000mL去離子水中加入Tris堿54g、硼酸27.5g、20mL0.5MEDTA(pH8.0),使用時(shí)利用去離子水10倍稀釋，即為0.5×TBE。A.2.2瓊脂糖凝膠在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的瓊脂糖，融化，冷卻至60℃后添加0.01%(v/v)的核酸染料并混勻，然后倒入插入梳子的制膠槽中，冷卻凝固后點(diǎn)樣電泳。A.3實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液商品化的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液，按照商品說明書使用。A.4NA培養(yǎng)基取蛋白陳5g,蔗糖10g,酵母提取物1g,牛肉浸膏3g,瓊脂16g,加水定容至1000mL,調(diào)pH7DB32/T4394—2022附錄B（資料性）梨火疫病基本信息細(xì)菌界(Eubacteria),變形菌門(Proteobacteria),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),腸桿菌目(Enterobacterales),腸桿菌科(Enterobacteriaceae),歐文氏菌屬(Erwinia),解淀粉歐文氏菌（E．a(chǎn)my-loΨora(Burrill)Winslowetal.)。B.2生物學(xué)特征多數(shù)單生。最適生長(zhǎng)溫度25℃~28℃,最適pH6.0~6.5。在NA培養(yǎng)基winiaamylovora)的菌落及菌體形態(tài)。圖B.1梨火疫病菌（Erwiniaamylovora）的菌落及菌體形態(tài)B.3田間癥狀特征病原菌主要通過傷口和自然孔口（氣孔、蜜腺、水孔等）侵入寄主組織。受害花、葉、嫩梢和果實(shí)等枯萎變黑，引起花腐、枝枯和僵果，但不脫落，被侵染的嫩枝呈“大量乳白色黏稠狀菌膿。圖B.2為梨火疫病田間典型病害癥狀。8DB32/T4394—2022（a）花和幼果受害癥狀（b）嫩稍和葉柄受害癥狀（c）枝干和樹皮受害癥狀（d）整株枯死癥狀圖B.2梨火疫病田間典型病害癥狀9DB32/T4394—2022（規(guī)范性）梨火疫病田間調(diào)查／監(jiān)測(cè)結(jié)果記錄表調(diào)查機(jī)構(gòu)：調(diào)查時(shí)間：調(diào)查人：編號(hào)調(diào)查地點(diǎn)果樹/材料品種/樹齡生育期來源種植面調(diào)查面發(fā)生面調(diào)查株發(fā)病株病株率(%)檢測(cè)鑒定結(jié)果備注注：材料指苗木、砧木、接穗和花粉等；備注欄可填寫田間癥狀、農(nóng)事操作、抽樣檢測(cè)情況等信息。DB32/T4394—2022（資料性）梨火疫病菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)程序捕獲抗體提前按照市售產(chǎn)品要求用包被液進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μL包被于96孔酶標(biāo)板上。4℃孵育12h~16h后棄去孔中液體，用洗滌液加滿每個(gè)反應(yīng)孔，靜置1min~2min后，將洗滌液緩慢倒出，重新加入新的洗滌液，重復(fù)上述步驟3次。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D.2封閉酶標(biāo)板中每孔加入200μL封閉液，37℃封閉1.5h后棄去封閉液，用洗滌液洗板3次，每次2min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D.3加樣加入梯度稀釋的樣品浸出液或菌懸液、梨火疫病菌菌懸液(108CFU/mL,陽(yáng)性對(duì)照）和樣品提取液（陰性對(duì)照每孔100μL。室溫孵育1h后棄去孔中液體，用洗滌液洗板4次，每次2min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。每個(gè)檢測(cè)樣品至少重復(fù)3次。D.4加酶標(biāo)檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物每孔加入100μL檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物，抗體-HRP復(fù)合物提前按照市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，置于保濕容器中，25℃孵育1h。用洗滌液洗板4次，每次2min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D.5顯色提前15min配好顯色液，每孔加入100μL,25℃避光顯色20min至陽(yáng)性對(duì)照顯色。D.6終止反應(yīng)顯色后在每孔加入50μL終止液。D.7測(cè)定在波長(zhǎng)450nm下用酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果，讀取各孔溶液的光密度值(OD值記錄結(jié)果。DB32/T4394—2022附錄E（規(guī)范性）PCR檢測(cè)E.1PCR凝膠電泳檢測(cè)表E.1為引物序列。引物序列pEA29A5'-CGGTTTTTAACGctGGG-3'pEA29B5'-GGGCAAATActCGGATT-3'E.1.2PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件25μL反應(yīng)體系：2×PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10μmol/L)1μL,模板1μL,補(bǔ)充超純水至25μL。保存。注：不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。E.1.3瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1000bp。圖E.1為梨火疫病PCR檢測(cè)凝膠電泳圖譜。圖E.1梨火疫病樣PCR檢測(cè)凝膠電泳圖譜在陽(yáng)性對(duì)照在預(yù)期位置產(chǎn)生明顯條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照在預(yù)期位置未產(chǎn)生條帶的前提下：a)如果檢測(cè)樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶，則為陽(yáng)性；b)如果檢測(cè)樣品沒有出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶，則為陰性；c)檢測(cè)結(jié)果至少重復(fù)3次。DB32/T4394—2022E.2實(shí)時(shí)熒光PCRE.2.1實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列表E.2為實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列。表E.2實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列序號(hào)引物或探針序列1Ea-lscF5'-CGctAACAGCAGATCGCA-3'Ea-lscR5'-AAATACGCGCACGACCAT-3'FA