超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒實驗解決方案

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理超氧化物歧化酶（SOD，EC）是催化超氧陰離子歧化成O2和H2O2的酶。它們是抗暴露于O2的所有細(xì)胞中超氧化物自由基毒性的重要抗氧化劑。異常的SOD活動與肌萎縮側(cè)索硬化，圍產(chǎn)期致死，神經(jīng)紊亂和癌癥等疾病有關(guān)。超氧化物歧化酶有三大類：Cu/Zn，F(xiàn)e/Mn和Ni型。人體中存在三種形式的超氧化物歧化酶。SOD1位于細(xì)胞質(zhì)中，SOD2位于線粒體中，SOD3位于細(xì)胞外。CheKine?超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（微量法），提供一種簡單易用的測定法，用于定量測定血清，血漿，組織/細(xì)胞和其它生物體液中的SOD酶活性。超氧陰離子（O2-）來源于黃嘌呤氧化酶（XO）催化反應(yīng)。O2-與四唑鹽WST-8反應(yīng)生成水溶性甲瓚。SOD清除O2-，因此產(chǎn)生更少的顯色反應(yīng)。用比色法測定了SOD在450nm處的抑制活性。SOD的活性與甲臜的生成量成負(fù)相關(guān)。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計（能測450nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·水浴鍋，離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備注意：各組分開蓋前，請先低速離心。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。SampleDiluent：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。1×LysisBuffer：使用前，平衡到室溫，LysisBuffer(5×)用去離子水稀釋至1×LysisBuffer，4℃保存。WST-8：即用型；整個實驗過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。Enhancer：即用型；整個實驗過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。注意：Enhancer正常為紫紅色溶液，如遇發(fā)黃，請與Abbkine工作人員聯(lián)系。Xanthine：即用型；整個實驗過程中，冰上避光放置；分裝保存于-20℃。如果該組分出現(xiàn)渾濁，使用前請短暫渦旋。WorkingXanthineOxidase：XanthineOxidase分裝保存于-20℃；用SampleDiluent將XanthineOxidase1:20的稀釋的到WorkingXanthineOxidase，臨用前配制，整個實驗過程中，冰上避光放置。WorkingReagent：臨用前配制；每孔吸取148μLAssayBuffer，10μLXanthine,5μLWST-8,1μLEnhancer，混勻后待用。樣本制備動物組織樣本：稱取0.1g組織加入1mL預(yù)冷的1×LysisBuffer將樣本進行勻漿。勻漿后的樣本，4℃,12,000g離心5min，取上清進行檢測。細(xì)胞樣本：收集5×106個細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞，800g離心2min，棄上清。加入1mL預(yù)冷的1×LysisBuffer懸浮細(xì)胞，冰上孵育10min后，4℃,12,000g離心5min，取上清進行檢測。注意：如果需要分別檢測胞漿和線粒體的SOD活性，組織/細(xì)胞樣本的制備，請參考Mattiazzietal(2002).JBC277:29626-33。血清、血漿樣本：按常規(guī)方法收集血清，SampleDiluent稀釋后即可作為血清樣本進行檢測；用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃，600g離心10min，移取上清至另一新的離心管中，適量SampleDiluent稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。植物樣本：稱取0.1g新鮮植物樣本，加入1mL預(yù)冷的1×LysisBuffer進行超聲波破碎。超聲波破碎3min（功率30%或300W，超聲3s，間隔7s），4℃，12,000g離心5min后，取上清進行檢測。注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。處理好的樣本須當(dāng)天檢測。測定過程中樣本在冰上放置，以免變性和失活。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到450nm，可見分光光度計用去離子水調(diào)零。測定前將WorkingReagent在37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）孵育5min以上。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑樣本孔（μL）樣本對照孔（μL）空白孔（μL）空白對照孔（μL）樣本202000WorkingXanthineOxidase400400SampleDiluent0402060WorkingReagent164164164164充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）孵育30min后，450nm處測定各孔吸光值A(chǔ)。計算ΔA樣本=A樣本-A樣本對照，ΔA空白=A空白-A空白對照。注意：空白孔和空白對照孔只需各做2-3孔；不同背景顏色的樣本需要各設(shè)置一個對照孔，去除樣本本身的背景色。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。抑制百分率的計算抑制百分率=(ΔA空白-ΔA樣本)÷ΔA空白×100%注意：盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用SampleDiluent適當(dāng)稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本。SOD酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。SOD酶活性計算：血清（漿）SOD活力計算：SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×n組織和細(xì)胞SOD活力計算：按樣本蛋白濃度計算SOD活性(U/mgprot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×n按樣本鮮重計算SOD活性(U/g鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×n按細(xì)胞數(shù)量計算SOD活性(U/104cells)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)×n=0.0224×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×nV反總：反應(yīng)體系總體積，0.224mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入1×LysisBuffer體積，1mL；n：樣本稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞