過氧化氫酶（CAT）Pro活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

過氧化氫酶（CAT）Pro活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理CheKine?Pro過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒（熒光法）可檢測動物或植物組織、細(xì)胞、血清（漿）或其他液體等樣本，其原理是在檢測體系中過氧化氫酶（CAT）分解H2O2產(chǎn)生水和氧氣，未分解的過氧化氫在酶和熒光物質(zhì)存在下反應(yīng)，其在激發(fā)波長535nm和發(fā)射波長587nm處的熒光強(qiáng)度與過氧化氫濃度成正比。自備耗材·熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長為535nm，發(fā)射波長為587nm）·全黑96孔板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·低溫離心機(jī)、恒溫箱、制冰機(jī)·去離子水，PBS(pH7.0)·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；用不完的試劑在-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。H2O2ReagentⅢ：臨用前配制；取5μLReagentⅢ加入4.995mL去離子水，混勻，取15μL稀釋后的ReagentⅢ，加入4.395mLAssayBuffer，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，按需配制，當(dāng)天內(nèi)使用。WorkingReagent：臨用前避光配制；取50μLReagentⅠ和20μLReagentⅡ，加入4.93mLAssayBuffer，充分混勻，該體積可用100次，按需配制，當(dāng)天內(nèi)使用，使用時(shí)須避光。Standard(1M)：使用前，用去離子水稀釋10,000倍得到0.1mM標(biāo)準(zhǔn)品，充分溶解待用。用不完的Standard(1M)-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。注意：ReagentⅠ有毒，ReagentⅢ有腐蝕性，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Standard設(shè)置：按下表所示，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。序號0.1mM標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）去離子水體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μM）Std.110010050Std.28012040Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.651952.5Std.72.5197.51.250（空白孔）02000注意：稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，盡快檢測，不宜長久放置。樣本制備注意：樣本以新鮮為宜，若不能立刻檢測，應(yīng)儲存在-80℃保存。1.動植物組織：稱取0.1g樣本，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。2.細(xì)胞：收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。3.血清或其他液體樣本：10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。注意：1.實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本用AssayBuffer稀釋成不同濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合本試劑盒的線性范圍：0.01-10U/mL，請參考下表稀釋（僅供參考）。樣本稀釋倍數(shù)樣本稀釋倍數(shù)10%小鼠腦30-6010%小鼠肺150-300胎牛血清2-10293cells4-10人唾液30-60L929細(xì)胞上清不稀釋人尿液30-5010%煙草葉2-6如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟1.熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱到37℃，調(diào)節(jié)激發(fā)波長為535nm，發(fā)射波長為587nm。2.操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：試劑測定孔（μL）對照孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）樣本2500Standard0025去離子水0025H2O2ReagentⅢ25250酶標(biāo)儀上振板10s，37℃反應(yīng)5minWorkingReagent505050樣本0250混勻，室溫避光靜置10min，熒光酶標(biāo)儀上設(shè)置激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長587nm，測定各孔熒光值，分別記為RFU測定、RFU對照、RFU標(biāo)準(zhǔn)和RFU空白，計(jì)算ΔRFU測定=RFU對照-RFU測定，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)=RFU標(biāo)準(zhǔn)-RFU空白。結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，將ΔRFU測定帶入方程得到x(μM)。CAT活性的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：37℃條件下，每mg蛋白每分鐘分解1nmoLH2O2的量為一個(gè)活力單位。CAT(U/mgprot)=x×f÷5÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：37℃條件下，每g組織每分鐘分解1nmoLH2O2的量為一個(gè)活力單位。CAT(U/g鮮重)=x×f÷5÷W按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活單位定義：37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘分解1nmoLH2O2的量為一個(gè)活力單位。CAT(U/104cell)=x×f÷5÷N按液體體積計(jì)算：酶活單位定義：37℃條件下，每mL液體每分鐘分解1nmoLH2O2的量為一個(gè)活力單位。CAT(U/mL)=x×f÷5Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；5：反應(yīng)時(shí)間，5min；f：樣本稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量，g；N：細(xì)胞總數(shù)，萬。結(jié)果展示ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)H2O2Standard(μM)Figure1.CAT的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例：取0.16g小鼠腦加入1mLAssayBuffer進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清稀釋50倍之后按照測定步驟操作，用全黑96孔板測得：RFU測定為10,395，RFU對照為16,600，RFU空白為305，ΔRFU測定=16,600-10,395=6,205，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=568.3x+501.83，H2O2濃度為10.04μM，CAT（樣本）=10.04×50÷5÷0.16=627.5U/g鮮重。取胎牛血清離心取上清稀釋5倍之后按照測定步驟操作，用全黑96孔板測得：RFU測定為6,380，RFU對照為13,390，RFU空白為305，ΔRFU測定=13,390-6,380=7010，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=568.3x+501.83，H2O2濃度為11.45μM，CAT（樣本）=11.45×5÷5=11.45U/mL。相關(guān)產(chǎn)品 Ca