BJS 201904 食品中多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法

附件4

食品中多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法

BJS201904

1范圍

本方法規(guī)定了肉及肉制品中豬、驢、山羊、綿羊、牦牛、鼠源性成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光

PCR方法。

本方法適用于肉及肉制品中豬（Susscrofa）、驢（Equusasinus）、山羊（Caprahircus）、

綿羊（Ovisaries）、牦牛（Bosgrunniens）、鼠源性成分的一種或多種成分同時(shí)定性檢測(cè)。

注：本方法中鼠源性成分包括海貍鼠（Myocastorcoypus）、小鼠（Musmusculus）、大鼠（Rattusnorvegicus）、

豚鼠（Caviaporcellus）和竹鼠（Rhizomyspruinosus）源性成分。

2原理

提取樣品DNA，通過(guò)特異性引物探針進(jìn)行動(dòng)物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR

擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)物熒光信號(hào)及擴(kuò)增曲線判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品動(dòng)物源性成分的定性分析。

3試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的要

求。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。

3.1檢測(cè)用引物和探針

(a)豬cytb基因檢測(cè)用引物探針序列為：

5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’

3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’

探針：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’

(b)驢nad5基因檢測(cè)用引物探針序列為：

5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’

3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’

探針：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’

(c)山羊cytb基因檢測(cè)用引物探針序列為：

5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’

3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’

探針：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’

(d)綿羊cytb基因檢測(cè)用引物探針序列為：

1

5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’

3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’

探針：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’

(e)牦牛cytb基因檢測(cè)用引物探針序列為：

5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’

3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’

探針：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’

(f)鼠cytb基因檢測(cè)用引物探針序列為：

5’端引物：5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’

3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’

探針：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’

3.2CTAB裂解液：2%(w/v)CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，

用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，121℃高壓滅菌20min，備用。

3.3蛋白酶K：20mg/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇（體積比25∶24∶1）。

3.5異丙醇，優(yōu)級(jí)純。

3.670%乙醇。

3.7實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液。以2×預(yù)混液為例，成分為：PCR緩沖液（終濃度1×），氯化

鎂（終濃度2.5mmol/L），dNTP（終濃度0.2mmol/L），TaqDNA聚合酶（終濃度1U）。

3.8TE緩沖液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA

（pH8.0）。

4儀器和設(shè)備

4.1組織研磨器。

4.2核酸蛋白分析儀。

4.3恒溫水浴鍋。

4.4離心機(jī)（最大離心力≥12000g）。

4.5微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。

4.6實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

4.7渦旋振蕩器。

4.8電子天平：感量0.01g。

4.9高壓滅菌鍋。

4.10pH計(jì)。

5分析步驟

2

5.1試樣選取與制備

多點(diǎn)采取肌肉組織，選取適量具有代表性的樣品進(jìn)行均質(zhì)處理。所用器皿應(yīng)為一次性耗

材，或經(jīng)過(guò)徹底清洗和高壓消毒并單獨(dú)使用。用過(guò)的器皿應(yīng)采取措施消除核酸的污染，否則

不可重復(fù)使用。

5.2DNA提取

稱取解凍后的均質(zhì)樣品0.1g~0.2g，置于2mL離心管中，加入600μLCTAB裂解液和20μL

蛋白酶K，振蕩混勻，65℃孵育1h~2h，期間每隔10min振蕩混勻；加入500μL的苯酚：三氯

甲烷：異戊醇（25∶24∶1），充分振蕩混勻，12000g離心5min；小心吸取上清液至潔凈的

1.5mL離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，12000g離心5min；棄去上清液，500μL70%

乙醇洗滌2次，12000g離心5min，棄上清液，晾干；加入50μL~100μLTE緩沖液或無(wú)菌雙蒸

水，溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。同法提取?yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。

也可用等效商品化的試劑盒提取DNA。

5.3DNA濃度和純度的測(cè)定

使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA濃度及純度，DNA濃度在1ng/μL~100ng/μL之間，

A260/A280值在1.7~2.0之間時(shí)，適宜于本方法。

5.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

各動(dòng)物源性成分PCR擴(kuò)增均采用20μL的反應(yīng)體系，包括PCR反應(yīng)預(yù)混液（2×）10μL，

5’端、3’端引物（10μmol/L）各0.2μL，探針（10μmol/L）0.1μL，DNA模板（1ng/μL~100ng/μL）

1μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足20μL。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)體系。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；35個(gè)循環(huán)（95℃15s，58℃1min，收集熒光）。

也可用等效的商品化試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。

5.5實(shí)驗(yàn)對(duì)照

實(shí)驗(yàn)過(guò)程分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。用相應(yīng)動(dòng)物源性成分生鮮肉樣品作為

陽(yáng)性對(duì)照，用不含相應(yīng)動(dòng)物源性成分的生鮮肉樣品作為陰性對(duì)照，用等體積的無(wú)菌雙蒸水代

替模板DNA作為空白對(duì)照。

6結(jié)果判斷與表述

6.1質(zhì)量控制

(a)空白對(duì)照：無(wú)FAM熒光信號(hào)檢出；

(b)陰性對(duì)照：無(wú)FAM熒光信號(hào)檢出；

(c)陽(yáng)性對(duì)照：有FAM熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤30.0。

否則判定為實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

6.2結(jié)果判定

3

(a)如有FAM熒光信號(hào)檢出，Ct值≤30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為被檢樣品陽(yáng)

性；

(b)如Ct值≥35或無(wú)Ct值，則判定為被檢樣品陰性；

(c)如有FAM熒光信號(hào)檢出，且30.0＜Ct值＜35.0，則重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如再次擴(kuò)增后Ct值

仍＜35.0，且有典型的擴(kuò)增曲線，則判定被檢樣品陽(yáng)性；否則判定被檢樣品陰性。

6.3結(jié)果表述

結(jié)果為陽(yáng)性者，表述為“檢出XX源性成分”。

結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出XX源性成分”。

7污染判定

在DNA濃度相對(duì)差值在20%以內(nèi)的情況下，本方法所檢測(cè)生鮮肉與陽(yáng)性對(duì)照差值＞6，

或肉制品與陽(yáng)性對(duì)照差值＞10，且結(jié)果可獨(dú)立重復(fù)，提示該源性成分含量低于2%。

8防污染措施

檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院、中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所、北京

維德維康生物技術(shù)有限公司。

驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)