高中生物備課課件（新教材人教版2019）選擇性必修三 3-1 DNA重組技術(shù)的基本工具

§3-1重組DNA技術(shù)的基本工具基因工程從社會(huì)中來(lái)番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因番木瓜（左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）在培育轉(zhuǎn)基因番木瓜時(shí)，首先要在體外對(duì)含有所需要基因的DNA分子進(jìn)行“切割”、改造和“拼接”；然后，將重組DNA分子導(dǎo)入番木瓜體細(xì)胞內(nèi)，并使其在細(xì)胞中表達(dá)。重組DNA技術(shù)的基本工具重組DNA技術(shù)的基本工具將DNA片段連接起來(lái)的“分子縫合針”切割DNA分子的“分子手術(shù)刀”將體外重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的“分子運(yùn)輸車”科學(xué)家正是靠這三種必需的工具，才使培育轉(zhuǎn)基因番木瓜這一奇妙構(gòu)想變成了現(xiàn)實(shí)?！胺肿舆\(yùn)輸車”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”簡(jiǎn)稱限制酶來(lái)源主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的思考Thinking你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”磷酸二酯鍵作用能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。特點(diǎn)大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成。例如，EcoRI、SmaI限制酶的識(shí)別序列均為6個(gè)核苷酸，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。【資料卡】限制酶名字的由來(lái)限制酶是如何命名的呢？是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichiacoli）的R型菌株分離來(lái)的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRⅠ。EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株分離第一個(gè)限制酶限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”結(jié)果DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端：限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)。黏性末端中軸線EcoRⅠ(在G與A之間切割)5’3’3’5’限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”結(jié)果DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端：限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開(kāi)。平末端：限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)。SmaⅠ(在G與C之間切割)5’3’3’5’平末端中軸線限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”作用將切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA分子（將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵）

1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，稱之為DNA連接酶（DNAligase）。5’3’DNA連接酶——“分子縫合針”種類E·coliDNA連接酶：來(lái)源：從大腸桿菌中分離得到的作用：只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)。T4DNA連接酶：來(lái)源：從T4噬菌體中分離出來(lái)的作用：可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端和平末端，但連接平末端的效率相對(duì)較低。DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？【提示】不是一回事。雖然DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，但兩者存在顯著的區(qū)別。（1）DNA聚合酶只能催化單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是催化單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶以一條DNA鏈為模板，催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA片段連接起來(lái)，它不需要模板。此外，兩者雖然都是蛋白質(zhì)，但它們的組成和性質(zhì)各不相同。思考Thinking基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”作用將外源基因送入細(xì)胞5’3’種類它們的來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。載體的種類質(zhì)粒（常用）噬菌體、動(dòng)植物病毒等【思考·討論】重組DNA分子5′-ATTGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3′3′-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5′5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3′3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5′請(qǐng)?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫(xiě)上下列兩段DNA序列：請(qǐng)你根據(jù)前面學(xué)過(guò)的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開(kāi)后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來(lái)?！舅伎肌び懻摗恐亟MDNA分子剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶?！咎崾尽扛鶕?jù)學(xué)生實(shí)際操作的情況進(jìn)行指導(dǎo)。如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。討論1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？【提示】不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？到社會(huì)中去隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，生產(chǎn)和銷售“分子工具”的公司大量涌現(xiàn)。感興趣的話，你可以登錄這些公司的網(wǎng)站，查詢和了解相關(guān)產(chǎn)品的特點(diǎn)、價(jià)格和使用說(shuō)明等。有些這樣的公司已成功上市，你還可以通過(guò)分析公司的股票價(jià)格走勢(shì)，大致了解公司的經(jīng)營(yíng)狀況以及投資者目前對(duì)該行業(yè)的認(rèn)可程度?！咎崾尽吭谡{(diào)查中需要了解企業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品的種類和產(chǎn)量、銷售渠道和銷售情況等，這樣才有可能對(duì)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)狀況進(jìn)行正確的判斷?！咎骄俊?shí)踐】DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理提取：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。例如：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。分離：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。目的要求了解DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。學(xué)會(huì)DNA粗提取的方法以及用二苯胺試劑對(duì)DNA進(jìn)行鑒定?！咎骄俊?shí)踐】DNA的粗提取與鑒定材料用具材料：新鮮洋蔥（也可以選擇香蕉、菠菜、菜花和豬肝等作為實(shí)驗(yàn)材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。研磨液和二苯胺試劑的配制方法參見(jiàn)教材附錄2。用具：燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網(wǎng)、三腳架、火柴、刀片和天平等?！咎骄俊?shí)踐】DNA的粗提取與鑒定方法步驟取材、研磨：約30g洋蔥、切碎+10mL研磨液，充分研磨。過(guò)濾、離心：漏斗墊紗布，將研磨液過(guò)濾到燒杯中，4℃冰箱中放置幾分鐘，取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管，1500r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液放入燒杯。粗提?。荷锨逡杭尤塍w積相等、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，10000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。研磨洋蔥用冷卻的酒精析出DNA【探究·實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定方法步驟鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。鑒定DNA鑒定結(jié)果【探究·實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定【提示】觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中出現(xiàn)了失誤等?！咎崾尽勘緦?shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？結(jié)果分析與評(píng)價(jià)【探究·實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定【提示】本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)【探究·實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定【提示】實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開(kāi)；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液（體積比為24:1），通過(guò)離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時(shí)DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實(shí)驗(yàn)用具就可以將兩者分開(kāi)。教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)DNA進(jìn)行了粗提取，請(qǐng)查閱資料，了解實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實(shí)驗(yàn)中所使用的方法進(jìn)行比較，總結(jié)兩種方法的異同。進(jìn)一步探究預(yù)習(xí)：基因工程的基本操作程序本課學(xué)習(xí)結(jié)束基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”質(zhì)粒的定義質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。特點(diǎn)：裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、具有自我復(fù)制能力位置：真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外本質(zhì)：環(huán)狀雙鏈DNA分子5’3’擬核質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞氨