外泌體研究進展課程03外泌體的鑒定

?第三課外泌體的鑒定《外泌體研究進展》課程解螺旋|

知識金牌外泌體電鏡檢測外泌體粒徑檢測內容外泌體標志蛋白檢測常見問題知識金牌Western

Blot檢測外泌體標志蛋白電鏡檢測外泌體形態(tài)粒徑檢測外泌體顆粒大小及分布解

螺

旋

| 陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長外泌體電鏡檢測01知識金牌透射電鏡原理解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌負染色技術用重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈾等）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色，使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。在電鏡觀測時，重金屬染色的區(qū)域是黑暗的，而未被染色的樣品顆粒則透明光亮，這種染色方法稱為負染技術。負染色是只染背景而不染樣品，與光學顯微鏡樣品的染色正好相反。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長Formvar-carbon載網(wǎng)

3.05mm

diameter.知識金牌透射電鏡樣品臺頂端模式圖解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.實物圖知識金牌外泌體電鏡檢測將exosome固定在載樣銅網(wǎng)上重懸100,000

×g離心的exosome沉淀到50-100

μl

2%

多聚甲醛； 如果是富集的冰凍exosome，融化并與等量4%PFA混合注：2%

PFA中的exosome可在4℃儲存一周將5

μl

exosome懸液加到Formvar-carbon載樣銅網(wǎng)上。也可將5到10

μl

exosome懸液滴加到封口膜上，將銅網(wǎng)Formvar膜面朝下放在懸液上；每份

exosome樣品準備2-3個銅網(wǎng)。將100μl

PBS加到封口膜上，用鑷子將銅網(wǎng)(Formvar膜面朝下)

放在PBS液滴上清洗重要:在所有步驟中，都應保持Formvar膜面濕潤，而另一面干燥.注：相同樣品的銅網(wǎng)可在同一PBS液滴中清洗將銅網(wǎng)放在50μl

1%

戊二醛液滴上5

min.將銅網(wǎng)放在100μl

ddH2O

2

min（洗8次）解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.知識金牌外泌體負染色處理及電鏡檢測將銅網(wǎng)放在50μl草酸雙氧鈾液滴上pH

7,

5

min將銅網(wǎng)放在50μl甲基纖維素液滴上10

min，冰上操作銅網(wǎng)放到樣品臺頂端的不銹鋼環(huán)上，在濾紙上吸去多余液體；空氣中干燥5到10

min將銅網(wǎng)裝在樣品盒子里，80

kV下拍攝電鏡照片.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.知識金牌外泌體電鏡結果Electron-microscopic

observation

of

whole-mounted

exosomes

purified

from

mouse

dendritic

cells.Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.茶托型解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長一側凹陷的半球形100

nm知識金牌外泌體電鏡結果Electron

microscopy

analysis

of

Exos

secreted

by

obese

adipose

tissue

macrophagesCell.

2017

Oct

5;171(2):372-384.e12.

doi:

10.1016/j.cell.2017.08.035.

Epub

2017

Sep

21.茶托型解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長200

nm知識金牌外泌體電鏡結果Nature.

2017

Jun

22;546(7659):498-503.

doi:

10.1038/nature22341.

Epub

2017

Jun

7.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長茶托型100

nm知識金牌外泌體電鏡結果Characterization

of

neuron-derived

exosomes

by

transmission

electron

microscopy

(TEM)Cell

Res.

2017

Jul;27(7):882-897.

doi:

10.1038/cr.2017.62.

Epub

2017

Apr

21解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Cancer

Res.

2016

Apr

1;76(7):1770-80.

doi:

10.1158/0008-5472.CAN-15-1625.

Epub

2016

Mar

18.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Sci

Rep.

2017

Nov

24;7(1):16214.

doi:

10.1038/s41598-017-15376-8.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Sci

Rep.

2016

Nov

7;6:36502.

doi:

10.1038/srep36502.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果100nmwide-field

EM

imaging

showed

multiple

human

brain

exosomes

of

sizes

ranging

from

50

to

150

nmJ

Biol

Chem.

2012

Dec

14;287(51):43108-15.

doi:

10.1074/jbc.M112.404467.

Epub

2012

Nov

5.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Am

J

Respir

Cell

Mol

Biol.

2016

Sep;55(3):450-61.

doi:

10.1165/rcmb.2016-0033OC.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長100

nmPurification

of

exosomes

from

equine

neutrophils.

Exosomes

are

visualized

by

electron

microscopy,知識金牌外泌體電鏡結果Urinary

exosomes

were

isolated

from

urine

collections

by

differential

ultracentrifugationNephrol

Dial

Transplant.

2015

Sep;30(9):1488-96.

doi:

10.1093/ndt/gfv128.

Epub

2015

Jun

3.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Nephrol

Dial

Transplant.

2015

Sep;30(9):1488-96.

doi:

10.1093/ndt/gfv128.

Epub

2015

Jun

3.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長500

nm200

nm知識金牌外泌體電鏡結果Isolated

exosomes

from

human

pediatric

CPCs

were

identified

via

Transmission

Electron

Microscopy.Circ

Res.

2017

Feb

17;120(4):701-712.

doi:

10.1161/CIRCRESAHA.116.309935.

Epub

2016

Nov

21.解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果Image

of

exosomes

from

HEK293Tcell

medium

through

a

transmission

electron

microscope.Mol

Ther.

2018

Jan

8.

pii:

S1525-0016(18)30008-X.

doi:

10.1016/j.ymthe.2018.01.001.

[Epub

ahead

of

print]解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體電鏡結果小結外泌體樣結構：1，通常為茶托型或一側凹陷的半球形2，大小50-150

nm左右；解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長外泌體粒徑檢測02知識金牌Nanoparticle

Tracking

Analysis解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌NTA分析儀器Malvern

NanoSight解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長ZetaViewqNano知識金牌解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌應用案例Biophysical

characterization

of

D283MED

exosomes.Nicomp

370,Particle

Sizing

Systems

Division,

USA解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長PLoS

One.

2012;7(7):e42064.

doi:

10.1371/journal.pone.0042064.

Epub

2012

Jul

27.Malvern

NanoSight外泌體標志蛋白檢測03知識金牌外泌體是細胞分泌的膜性囊泡，右圖即為外泌體結構示意圖。研究發(fā)現(xiàn)，膜上的突起是外泌體的膜蛋白，其在靶向結合過程中有著重要作用。內含物主要是蛋白質和RNA，RNA種類主要是miRNA，其他就是lncRNA、mRNA、tRNA以及一些RNA片段。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長外泌體的結構知識金牌外泌體檢測時的指標蛋白頻率最高的指標：CD63、Tsg101、CD9和CD81常見指標：Alix、HSP70、flotillin

和Syntenin；其他指標：HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT等。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌應用案例Nature.

2017

Aug

3;548(7665):52-57.Cell.

2017

Oct

5;171(2):372-384解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌外泌體WB檢測中有沒有內參？解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌文獻報道的抗體公司解

螺

旋

| 陪

伴

醫(yī)

生

科

研

成

長CD63

抗體的供應商：文獻報道較多的兩個公司Abcam

(ab68418和ab8219)

和Santa

Cruz

(sc-5275)，其他公司有Systems

Biosciences

Inc、Abnova

(clone

MEM-259)、BD

Pharmingen

(551458)。Tsg101抗體的供應商：文獻報道較多的兩個公司Abcam（ab125011）和Santa

Cruz

（sc-7964），其他公司有Thermo

Pierce和Sigma-Aldrich。CD9抗體的供應商：文獻報道較多的是Abcam

(ab92726)，其他的公司有Santa

Cruz和Systems

Biosciences

Inc。CD81抗體的供應商：文獻報道較多的是Santa

Cruz

(sc-9158和H-121)，其他的公司有Novus

Biologicals

(Cat#

NB100–65805)、ImmunoWay。Alix抗體的供應商：文獻報道的公司有Cell

Signaling

(#2171)、Santa

Cruz、Abcam。HSP70抗體的供應商：文獻報道的公司有Abcam

(ab19136)、Santa

Cruz

(sc-24)。flotillin抗體的供應商:

文獻報道的公司有BD

Bioscience。Syntenin抗體的供應商：文獻報道的公司有ThermoFisher

Scientific

(Cat#

PA5-28826)

和Abcam

(ab133267)。常見問題04知識金牌存儲溫度對外泌體有影響嗎？Effects

of

storage

conditio