全國省級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)新員工培訓(xùn)-趙冰

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室生物安全及細(xì)菌學(xué)檢查2017全國省級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)新員工培訓(xùn)班北京國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室趙冰實(shí)驗(yàn)室生物安全與生物材料一起安全地工作!2025/2/10什么是生物危害？指對活的有機(jī)體的健康，主要是對人類的健康造成威脅的生物學(xué)物質(zhì)。生物危險(xiǎn)包括醫(yī)學(xué)廢物或微生物標(biāo)本、病毒或（來自生物源的）毒素，影響人類健康或?qū)?dòng)物產(chǎn)生危害。什么是生物安全?有關(guān)感染性微生物污染和危險(xiǎn)生物材料的安全操作三者互相影響

工作人員

實(shí)驗(yàn)室

標(biāo)本20世紀(jì)50-60年代生物安全實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)在美國；1983年WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》，2004年第三版。相關(guān)的文件法規(guī)1987年第一個(gè)生物三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中華人民共和國傳染病防治法（2004)國務(wù)院424號(hào)令：《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》

《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2004）《人間傳染的病原微生物名錄》(2006.01.11)國家對病原微生物實(shí)行分類管理

國家根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對個(gè)體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類：第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。第四類病原微生物，是指在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物。其中，第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。生物安全與污染的相互關(guān)系設(shè)計(jì)與設(shè)施設(shè)備（安全與其他）操作規(guī)則（標(biāo)準(zhǔn)的及微生物專業(yè)操作）9操作規(guī)則消除或最小化生物危害專門的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備僅僅是一種補(bǔ)充，絕不能替代正確的操作規(guī)范最重要的概念：進(jìn)入規(guī)定個(gè)人防護(hù)操作程序?qū)嶒?yàn)室工作區(qū)域生物安全管理10基本的生物安全設(shè)備生物安全柜生物安全離心機(jī)高壓滅菌器紫外燈11實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和設(shè)施在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室和安排某些類型的實(shí)驗(yàn)工作時(shí)，對于那些可能造成安全問題的情況要加以特別關(guān)注:

…………氣溶膠的形成處理大容量和∕或高濃度微生物儀器設(shè)備過度擁擠和過多嚙齒動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的侵?jǐn)_未經(jīng)允許人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本和試劑的工作流程對實(shí)驗(yàn)室實(shí)行分級(jí)管理國家根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對病原微生物的生物安全防護(hù)水平，并依照實(shí)驗(yàn)室生物安全國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，將實(shí)驗(yàn)室分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)。13一級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)–一級(jí)生物安全水平基礎(chǔ)的教學(xué)、研究 GMT 開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)14二級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)–二級(jí)生物安全水平

初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)；診斷、研究GMT+加防護(hù)服、生物危害標(biāo)志 開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)，此外需生物安全柜用于防護(hù)可能生成的氣溶膠15三級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室防護(hù)–三級(jí)生物安全水平

特殊的診斷、研究 在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流生物安全柜和／或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備16四級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室最高防護(hù)–四級(jí)生物安全水平 危險(xiǎn)病原體 在三級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物品的特殊處理Ⅲ級(jí)生物安全柜或Ⅱ級(jí)生物安全柜并穿著正壓防護(hù)服、雙開高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣Hi，我們不是宇航員結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌學(xué)檢查

涂片、培養(yǎng)和藥敏18

結(jié)核菌是由德國科學(xué)家科赫于1882年發(fā)現(xiàn)的。歷史條件：19世紀(jì)80年代是細(xì)菌學(xué)的全盛時(shí)代。當(dāng)時(shí)，用染片方法找病原菌方面已有德國病理學(xué)家魏格特的美蘭法，又有德國科學(xué)家歐利希德加熱固定法。發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌的技術(shù)條件已成熟。早期歷史簡介目的：診斷傳染性結(jié)核病監(jiān)控治療效果確定完成治療為流行病學(xué)疫情評價(jià)服務(wù)涂陽患病率、涂陽發(fā)病率意義：痰涂片顯微鏡檢查是診斷傳染性結(jié)核病的最有效手段之一痰涂片顯微鏡檢查陽性的患者比陰性患者的傳染性高出10倍以上。準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷對于挽救病人生命、改善公眾健康非常重要。痰涂片顯微鏡檢查的目的和意義

20六、痰涂片檢查對象

確定診斷：就診及轉(zhuǎn)診的結(jié)核病可疑癥狀者（即時(shí)痰、夜間痰、晨痰）療效評價(jià)：初治涂陽患者在療程滿2、5、6月時(shí)，復(fù)治涂陽患者在療程滿2、5、8月時(shí)，按期送檢兩份痰（晨痰、夜間痰）初、復(fù)治涂陽患者在療程強(qiáng)化期結(jié)束時(shí)，痰菌仍為陽性者，應(yīng)在治療第3個(gè)月末增加痰涂片檢查1次。確診、登記的涂陰肺結(jié)核患者，即使患者因故未接受治療，也應(yīng)在登記后滿2個(gè)月和6個(gè)月時(shí)進(jìn)行痰菌檢查。抗酸菌非抗酸菌堿性復(fù)紅加熱

Z－N染色的原理

細(xì)胞壁脂質(zhì)復(fù)合物抗酸菌非抗酸菌堿性復(fù)紅脫色Z－N染色原理－4復(fù)染24萋尼氏染色鏡下形態(tài)25熒光染色鏡下形態(tài)抗酸桿菌陰性、抗酸桿菌陽性1+….4+。我國絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。公共衛(wèi)生領(lǐng)域很有優(yōu)勢的技術(shù)（簡單、快速、價(jià)格低廉需要設(shè)備簡單等）。檢測很少量標(biāo)本:0.01-0.1ml。檢出率低（需要標(biāo)本中含較多菌才能檢測到，理論上標(biāo)本中每毫升至少需5000－10000個(gè)抗酸菌/ml），同時(shí)也提示只要涂片陽性，則痰中菌量很大。熒光法敏感度增加（約10%），讀片時(shí)間需要更短。萋尼氏染色法特異性較高，例如熒光染色法不能確定的涂片，以及分離培養(yǎng)物（羅氏培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物）均需經(jīng)萋尼氏染色法進(jìn)行確定。

涂片染色鏡檢特點(diǎn)分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定2728為什么進(jìn)行培養(yǎng)對痰涂片陰性的病人進(jìn)行診斷獲得藥敏試驗(yàn)所需的純培養(yǎng)物-MDR診斷：是獲得藥敏試驗(yàn)所需純培養(yǎng)物的前提和基礎(chǔ)療效判斷：是評價(jià)治療效果的重要指標(biāo)結(jié)核分枝桿菌的生長要求：

兼性需氧菌最適生長溫度為37℃

最適PH為6.5～7.2

營養(yǎng)要求：氮源、碳源、無機(jī)鹽（磷、鐵、鎂、鉀、硫等）、生長因子生長緩慢：在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10多小時(shí)，一般10-30天肉眼可見菌落生長。29如何進(jìn)行培養(yǎng)固體培養(yǎng)-簡單法，中和離心法液體培養(yǎng)-中和離心法30標(biāo)本的選擇標(biāo)本－3涂2培原則3份痰標(biāo)本均為陽性：選取陽性級(jí)別高的2份痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)；3份痰標(biāo)本2份陽性：選取2份陽性痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)；3份痰標(biāo)本1份陽性：選取陽性標(biāo)本和1份質(zhì)量好的陰性標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)3份痰標(biāo)本均為陰性：選取2份質(zhì)量好的陰性標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。31痰標(biāo)本1－2倍4%

NaOH振蕩勻化靜置15分鐘均勻接種0.1ml,2支/標(biāo)本斜面向上，37℃水平放置24小時(shí)37℃豎直培養(yǎng)8周32分枝桿菌培養(yǎng)陽性33陰性培養(yǎng)陽性培養(yǎng)無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強(qiáng)熒光傳感器對氧氣高度敏感的釕復(fù)合物液體培養(yǎng)基改良Middlebrook7H9培養(yǎng)基上部空間已預(yù)先充填10%CO2

BACTEC?MGIT?960操作系統(tǒng)

液體培養(yǎng)優(yōu)勢分枝桿菌生長更好比固體培養(yǎng)基的陽性率更高(15-30%)對非肺部樣本,其檢出率更高對涂片陰性樣本,其檢出率更高適用于更多種類的分枝桿菌生長報(bào)告時(shí)間更快(12-14天)更好和更快的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(4-13天)生化對硝基苯甲酸（PNB），噻吩-2-羧酸肼（TCH），耐熱觸媒，硝酸還原，煙酸生成。。。分子生物學(xué)測序，PCR，線性探針，基因芯片，質(zhì)譜，基因探針。。。其他免疫學(xué)方法分枝桿菌酸抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)的目的1.科學(xué)研究目的了解化療的機(jī)制,研究治療成功與失敗的原因2.流行病學(xué)研究某一時(shí)間某一地點(diǎn)原發(fā)耐藥/獲得性耐藥的流行情況3.制定大范圍治療結(jié)核病患者的計(jì)劃估算全敏感的患者數(shù)量4.為患者制定個(gè)體化的治療方案診斷耐藥結(jié)核病、選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病治療方案）基本原理耐藥的產(chǎn)生耐藥是細(xì)菌群體的一種基本的現(xiàn)象。對于空洞型肺結(jié)核病患者，在開放性空洞中細(xì)菌的含量可達(dá)107-109，而干酪樣壞死病變中細(xì)菌含量一般不超過102-104。結(jié)核分枝桿菌存在自發(fā)的突變，每代每個(gè)細(xì)菌對以下藥物的平均突變概率分別為：

INH：3×10-8，

SM：3×10-8，

EMB：1×10-7，

RMP：2×10-10，

理論上對兩種藥物同時(shí)耐藥的突變概率為10-15。耐藥的產(chǎn)生根據(jù)廣泛認(rèn)同的理論，耐藥的產(chǎn)生是由于在治療過程中對患者體內(nèi)已存在的耐藥突變菌選擇和增殖的結(jié)果。在應(yīng)用鏈霉素治療結(jié)核病的過程中發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。如果單獨(dú)給予鏈霉素，開始時(shí)患者的癥狀迅速改善，痰菌減少；但隨后患者的癥狀惡化，痰菌增多，表現(xiàn)出耐藥，患者的分離菌株可以在含鏈霉素的培養(yǎng)基上生長。對照培養(yǎng)基(drug-free)含藥培養(yǎng)基所有菌落均生長僅耐藥菌生長藥敏試驗(yàn)方法世界衛(wèi)生組織推薦的藥敏試驗(yàn)方法基于生長觀察：固體培養(yǎng)方法比例法絕對濃度法抗性比率法基于生長檢測（產(chǎn)生二氧化碳、消耗氧氣等）液體藥敏法基于基因突變檢測探針雜交、測序等方法

中國疾控中心結(jié)控中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室2013年全國結(jié)核病耐藥監(jiān)測NationalSurveyofDrug-resistantTuberculosisinChina（2013）2013年結(jié)核病監(jiān)測基本情況監(jiān)測點(diǎn)：70個(gè)；抽樣方法：分層整群隨機(jī)抽樣；監(jiān)測時(shí)間：2013年1月1日-12月31日；監(jiān)測對象：診斷為活動(dòng)性結(jié)核病的初、復(fù)治患者；最低樣本含量：初治S+：3000初治S-C+：748復(fù)治S+：527患者納入情況應(yīng)納入初治涂陽患者3000人，實(shí)際納入4628人；應(yīng)納入初治涂陰培陽患者748人，實(shí)際納入1912人；合計(jì)納入初治患者6540例；應(yīng)納入復(fù)治涂陽患者527人，實(shí)際納入758人