谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒實驗解決方案

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與活性氧（ROS）反應，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而保護生物膜免受ROS的損害，維持細胞的正常功能；而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-Px的必需部分，測定GSH-Px的活力可以作為衡量機體硒水平的一項生化指標。CheKine?谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動物組織、細胞、細菌樣本中GSH-Px的活性。GSH-Px催化H2O2氧化GSH，產生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340nm光吸收減少速率來計算GSH-Px活性。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·恒溫箱·96孔UV板或微量石英比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭·低溫離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingSubstrate：臨用前配制，Substrate加入20mLAssayBuffer，充分溶解；未用完的試劑分裝避光于-20℃保存1個月。GR：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。WorkingH2O2：臨用前配制，吸取21.5μLH2O2加入5mL去離子水，充分混勻，配制好的試劑當天使用；4℃避光保存。WorkingReagent：臨用前配制，根據樣本數量，按照2mLWorkingSubstrate加入1μLGR的比例配制，再加6mL的AssayBuffer混勻（當天用完）；WorkingRegent在25℃（其他物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min以上。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。1.組織樣本：用冷的PBS清洗組織，盡可能去除血液。吸干組織上的水分，稱重。稱取0.1g組織樣本，加入1mL預冷的AssayBuffer，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。2.血清（漿）：直接測定（如需要可用生理鹽水稀釋不同倍數）。3.細胞、細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mL預冷的AssayBuffer，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。注意：樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；細胞中GSH-Px活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中GSH-Px的提取時可加AssayBuffer后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟1.酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計用去離子水調零。2.WorkingRegent于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）孵育30min。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加樣：試劑空白孔（μL）測定孔（μL）去離子水200Sample020WorkingReagent160160WorkingH2O220204.充分混勻，空白孔在340nm處第10s和第10min10s的吸光值，分別記為A1，A2，測定孔在340nm處第10s和第10min10s的吸光值，分別記為A3，A4，計算ΔA空=A1-A2，ΔA測=A3-A4。注意：空白孔只需做1-2個即可。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。如果ΔA測小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA測大于1.0，樣本可用AssayBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。使用96孔UV板測定的計算公式如下：1.按蛋白濃度計算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mgprot)=[(ΔA測-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T=321.6×(ΔA測-ΔA空)÷Cpr2.按樣本鮮重計算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每克樣品每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/g鮮重)=[(ΔA測-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=321.6×(ΔA測-ΔA空)÷W3.按細胞或細菌數量計算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每104個細胞或細菌每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/104)=[(ΔA測-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=321.6×(ΔA測-ΔA空)÷5004.按液體體積計算活性單位定義：在25℃或37℃溫度下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mL)=[(ΔA測-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷V樣÷T=321.6×(ΔA測-ΔA空)ΔA空=A1-A2，ΔA測=A3-A4；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質量，g；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=2×10-2mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間，10min；500：細胞或細菌數量，500萬。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中的光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1600Che