諸氏鯔蝦虎魚 毒理學評價 第1部分：急性毒性

1DB44/TXXXX.1—2021諸氏鯔蝦虎魚毒理學評價第1部分：急性毒性本文件規(guī)定了諸氏鯔蝦虎魚毒理學評價中急性毒性的原理、方法、器材、評價步驟、質量控制、數(shù)據(jù)與報告、安樂死和實驗室廢棄物處理等要求。本文件適用于直接或間接排入海洋、入海河口的污染物及受納水體的急性毒性評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運輸GB17378.5海洋監(jiān)測規(guī)范第5部分：沉積物分析GB/T18420.2-2009海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性第2部分：檢驗方法GB30980海洋傾倒物質評價規(guī)范疏浚物GB/T39649實驗動物實驗魚質量控制HJ91.1污水監(jiān)測技術規(guī)范HJ493水質采樣樣品的保存和管理技術規(guī)定NY5052無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質SN/T3592實驗室化學藥品和樣品處理的標準指南3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1實驗魚3.1.1實驗諸氏鯔蝦虎魚LaboratoryMugilogobiuschulae經(jīng)人工繁育，對其攜帶的病原微生物及寄生蟲進行控制，遺傳背景明確或來源清楚，用于科學研究、教學、生產(chǎn)、檢定及其他科學實驗的諸氏鯔蝦虎魚。中文名：諸氏鯔蝦虎魚，學名：Mugilogobiuschulae。分類地位：鱸形目（Perciformes），蝦虎魚亞目（Gobioidei），蝦虎魚科（Gobiidae），鯔蝦虎魚屬（Mugilogobius）。3.1.2仔魚larvafish從孵出開始至各鰭鰭條發(fā)育完整，鱗片開始出現(xiàn)為止。3.1.32DB44/TXXXX.1—2021日齡daysofage自受精始，以日為單位表述的實驗魚年齡。3.1.4馴養(yǎng)domestication試驗前對實驗生物進行的環(huán)境適應性養(yǎng)殖。3.2受試物3.2.1污水sewage指在生產(chǎn)與生活活動中排放的水的總稱。[來源：GB8978-1996，3.1]3.2.2海洋沉積物marinesediments各種沉積作用所形成的海底沉積物的總稱。[來源：GB/T30740-2014，3.1]3.2.3疏浚物dredgedmaterials為保障港口、碼頭、航道、錨地通行使用順暢，滿足港口設施及其他涉海工程建設需要從水下挖掘出的沉積物。[來源：GB30980-2014，3.2]3.3毒理學評價3.3.1急性毒性acutetoxicity機體接觸外源物質后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應。3.3.2靜態(tài)毒性試驗statictoxicitytest試驗期間內(nèi)不更換試驗溶液，進行觀察、測定生物異?；蛩劳鲂脑囼灐?.3.3半靜態(tài)毒性試驗semi-statictoxicitytest以定期（如24h）更換試驗溶液的方式進行的試驗。3.3.4流水毒性試驗flow-throughtoxicitytest以整個試驗過程中試驗溶液自動、持續(xù)地被更換的方式進行的試驗。3.3.5半數(shù)致死濃度halflethalconcentration,LC50在一定觀察期內(nèi)，造成50%的實驗魚死亡的毒物濃度。[來源：GB/T18420.2－2009，3.3]4原理魚類對水環(huán)境的變化反應十分靈敏，當水中溶解的污染物達到一定濃度或強度時，就會引起一系列中毒反應，例如行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變，直至死亡。在規(guī)定的條件下，通過觀察測定3DB44/TXXXX.1—2021諸氏鯔蝦虎魚在一定的試驗時間內(nèi)接觸試驗物質后的異?；蛩劳鲂?，得出污染物對諸氏鯔蝦虎魚有明顯影響的具體濃度。5方法分為靜態(tài)毒性試驗、半靜態(tài)毒性試驗和流水毒性試驗。試驗期間受試物實測濃度與配制濃度偏差超過20%，宜采用半靜態(tài)毒性試驗或流水毒性試驗。當受試物穩(wěn)定性不明確時，仔魚推薦采用靜態(tài)毒性試驗，成魚采用半靜態(tài)毒性試驗或流水毒性試驗。6器材6.1主要儀器設備6.1.1諸氏鯔蝦虎魚和餌料生物的養(yǎng)殖設備、水處理設備等。6.1.2測定環(huán)境因子的溶氧儀、鹽度計、pH計、溫度計等。6.1.3電子天平、高速攪拌器、生物顯微鏡、游標卡尺、惰性材料容器、量筒、膠頭滴管、手抄網(wǎng)等。6.2諸氏鯔蝦虎魚6.2.1質量應符合GB/T39649的規(guī)定。繁育方法見附錄A。試驗前應馴養(yǎng)合格。諸氏鯔蝦虎魚的馴養(yǎng)應符合附錄B的規(guī)定。6.2.2規(guī)格不同試驗方法采用的諸氏鯔蝦虎魚規(guī)格應符合表1的規(guī)定。表1諸氏鯔蝦虎魚規(guī)格d6.2.3餌料仔魚餌料褶皺臂尾輪蟲，質量應符合GB/T39649中7.3.2的規(guī)定。成魚餌料鹵蟲無節(jié)幼體，質量應符合GB/T39649中7.3.2的規(guī)定。6.3受試物污水采樣應符合HJ91.1的相關規(guī)定，樣品貯存和運輸規(guī)定應符合HJ493的相關規(guī)定。海洋水質樣品采集、儲存和運輸應符合GB17378.3的相關規(guī)定。海洋沉積物樣品采集、預處理和保存應符合GB17378.5的相關規(guī)定。4DB44/TXXXX.1—2021疏浚物樣品采集、運輸和儲存方法應符合GB30980的相關規(guī)定。樣品標簽應包含名稱、編號、采樣人、采樣時間、數(shù)量、來源、采樣條件等信息。如可能，應提供受試物的水溶解度、主要毒性成分測定方法、保存條件、危險性、在水和光中的穩(wěn)定性、蒸氣壓、快速生物降解結果等信息。6.4參比物質分析純或以上等級的十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate，SDS）。6.5麻醉劑MS-222溶液，間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）與碳酸氫鈉(NaHCO3)按1∶1質量比混合，溶于水配制成一定濃度的溶液，密封避光保存于陰涼處，保存時間不超過一個月。7評價步驟7.1樣品準備7.1.1稀釋水宜使用天然海水，也可使用人工配制海水。水質應符合NY5052的規(guī)定，pH7.0～8.5。當納污水體鹽度已知時，稀釋水鹽度應與納污水體鹽度相同；當納污水體鹽度未知時，稀釋水鹽度宜配制成（30±2）‰。7.1.2貯備液配制污水等液體樣品，搖勻，取一定質量的樣品，加入稀釋水定容至一定體積，2000r/min攪拌15min，配制成預定濃度的貯備液。低水溶性物質可采用超聲波或其他適當?shù)奈锢矸椒ǚ稚?，也可采用對諸氏鯔蝦虎魚低毒或無毒的助溶劑（有機溶劑、乳化劑或分散劑）將其溶解或分散。試驗溶液中助溶劑的最高濃度不得超過0.1‰。疏浚物按GB30980-2014中8.2.1的規(guī)定執(zhí)行。其他固體廢棄物，取一定質量的樣品，加入若干體積的稀釋水，2000r/min～3000r/min攪拌30min，然后稀釋為試驗組的最高濃度，繼續(xù)攪拌5min，靜置60min。用虹吸法取水相中層作為貯備液。如貯備液pH值超出7.0～8.5，則宜采用HCl或NaOH溶液調節(jié)貯備液pH值至該范圍。7.2預試驗設置5個等比濃度組和1個對照組。若使用助溶劑應增設助溶劑對照組，助溶劑的濃度應與試驗組中助溶劑的最高濃度一致?？刹捎幂^大的等比系數(shù)，可不設平行組。每個容器放5尾～10尾諸氏鯔蝦虎魚。觀察并記錄諸氏鯔蝦虎魚24h（或48h、96h）的死亡情況，宜確定全部死亡和無死亡的濃度范圍。7.3限度試驗當預試驗結果受試物LC50高于100mg/L、原水樣或受試物在試驗條件下最大飽和濃度時，可相應進行濃度為100mg/L、原水樣或受試物在試驗條件下最大飽和濃度的限度試驗。設置1個濃度組和1個對照組。若使用助溶劑應增設助溶劑對照組，助溶劑的濃度應與試驗組中助溶劑的最高濃度一致。各試驗組設3個平行。5DB44/TXXXX.1—20217.4正式試驗7.4.1試驗濃度設定根據(jù)預試驗結果選擇合適的濃度范圍，至少應設定5個濃度組（等比系數(shù)不宜大于2.0并設一個空白對照組。若使用助溶劑應增設助溶劑對照組，助溶劑的濃度應與試驗組中助溶劑的最高濃度一致。各試驗組設3個平行。7.4.2諸氏鯔蝦虎魚分放仔魚采用適度強光誘使集中，用膠頭滴管或手抄網(wǎng)在馴養(yǎng)箱中隨機撈取，從低濃度組開始依次向高濃度組分放，每個容器10尾，在30min內(nèi)完成。7.4.3試驗環(huán)境條件同馴養(yǎng)環(huán)境條件，見附錄B中的表B.1。7.4.4諸氏鯔蝦虎魚投喂每尾仔魚每天投喂約50個褶皺臂尾輪蟲；每尾成魚每天投喂約30個鹵蟲無節(jié)幼體。每個試驗容器每次投喂體積不超過0.2mL。7.4.5試驗溶液更換靜態(tài)毒性試驗不更換試驗溶液。半靜態(tài)毒性試驗定期（推薦24h）更換一次試液，每次更換量為原試液體積的1/4～1/2。宜采用虹吸方式吸出原液，緩慢加入新液，操作過程中應避免觸碰諸氏鯔蝦虎魚。流水毒性試驗應根據(jù)受試物的穩(wěn)定性，每4h～12h更換一次貯備液。一個試驗容器24h的流量至少為該容器內(nèi)試驗溶液體積的5倍。試驗期間流速變幅不大于10%。7.4.6試驗觀察和記錄試驗開始和結束時應分別測量試驗溶液水溫、溶解氧、pH值、鹽度。試驗期間每隔24h應測量一次試液溫度。每24h觀察一次諸氏鯔蝦虎魚的體色、體形、活動、死亡等毒性效應。用膠頭滴管輕吹諸氏鯔蝦虎魚無反應的判為死亡個體，應及時移出死亡個體。流水毒性試驗每隔24h應測量一次流速。應將觀測結果記錄于原始紀錄表內(nèi)，見附錄C中的表C.1。7.5參比物質試驗外來諸氏鯔蝦虎魚試驗前應進行1次參比物質的24h生物毒性試驗；本實驗室繁育的諸氏鯔蝦虎魚，每月或每次毒性試驗前進行1次參比物質的24h生物毒性試驗。8質量控制有效的試驗應符合以下條件：試驗結束時，對照組（包括空白對照組和溶劑對照組）諸氏鯔蝦虎魚死亡率不超過10%；在23.0℃~27.0℃條件下，參比物質十二烷基硫酸鈉（SDS）對8日齡～14日齡諸氏鯔蝦虎魚仔魚的24hLC50應在0.6mg/L～2.4mg/L之間；對諸氏鯔蝦虎魚成魚的24hLC50應在1.8mg/L~4.6mg/L之間；6DB44/TXXXX.1—2021 原始記錄應完整，包括樣品名稱、編號、試驗時間、評價依據(jù)、馴養(yǎng)及質量控制記錄等。9結果與報告9.1結果計算按照GB/T18420.2-2009中規(guī)定的方法計算LC50及其95%置信限。9.2評價報告評價報告應包括以下內(nèi)容：a)受試樣品的名稱、來源、保存方法、保存時間等；b)諸氏鯔蝦虎魚來源、日齡或體長、馴養(yǎng)情況及SDS的24hLC50值；c）試驗條件：1）試驗方法，如靜態(tài)毒性試驗、半靜態(tài)毒性試驗或流水毒性試驗；2）貯備液和試驗溶液的配制方法、濃度；3）各試驗容器諸氏鯔蝦虎魚的數(shù)量；4）試驗溶液加入前和試驗結束時的水質因子，如水溫、溶氧、鹽度、pH等；1）各試驗組諸氏鯔蝦虎魚的死亡數(shù)；2）試驗期間，受試物對諸氏鯔蝦虎魚的毒性效應；3）96h的LC50值及其95%的置信區(qū)間；4）試驗期間，可能會影響試驗結果的因素。10諸氏鯔蝦虎魚安樂死試驗結束時向每個試驗容器中加入MS-222溶液，使終濃度為100mg/L～500mg/L，對實驗魚實施安樂死。MS-222溶液的配制方法見6.5。11實驗室廢棄物處理按SN/T3592的規(guī)定執(zhí)行。7DB44/TXXXX.1—2021附錄A（資料性）諸氏鯔蝦虎魚繁育方法A.1生物學特性諸氏鯔蝦虎魚為暖水性底層小型海水魚類，廣泛分布于北至日本，南至菲律賓及印度尼西亞等西太平洋近岸、河口淺水水域。全長小于5.0cm，性情溫順，廣溫、廣鹽，耐低氧。繁殖力強，雌魚懷卵量可高達4000粒，控溫條件下全年可多次繁殖。諸氏鯔蝦虎魚的形態(tài)特征：a)第一背鰭第二至第四鰭棘末端延長呈絲狀，以第二和第三鰭棘最長；第一背鰭下的頸背部有斜行帶狀條紋，尾鰭基部有兩個垂直排列的圓形或橢圓形斑點；b)鰭式為D.V～VI，I-6～10；A.I-5～10；P.12～17；V.I-7～12（圖A.1）。性成熟的雌魚外生殖突膨大，外觀呈橢圓形，無色素沉淀，半透明狀，泄殖孔較大，位于生殖突的次末端，兩側稍隆起；雄魚外生殖突比雌魚小得多，呈三角形，顏色較深，泄殖孔開口于最末端。圖A.1諸氏鯔蝦虎魚形態(tài)特征（模式圖引自伍漢霖，2008）A.2諸氏鯔蝦虎魚培育環(huán)境諸氏鯔蝦虎魚培育用水可采用天然海水或海鹽配制水，水質應符合NY5052的要求。適宜環(huán)境因子范圍為：水溫22.0℃~30.0℃,鹽度10‰～30‰，溶解氧≥4.0mg/L，pH7.0～8.5，自然光照或明暗時間比約為14h:10h，水面照度54lx～324lx。A.3繁殖與孵化選擇諸氏鯔蝦虎魚120日齡～360日齡健康親魚。配對產(chǎn)卵后，宜及時移走親本。受精卵適宜孵化條件為：水溫24.0℃~26.0℃、鹽度10‰～20‰、溶解氧≥4.0mg/L、pH7.0~8.5、水面照度200lx左右。同一批收集的仔魚孵出時間間隔不超過24h。A.4諸氏鯔蝦虎魚的投喂管理8DB44/TXXXX.1—20212日齡仔魚開始投喂褶皺臂尾輪蟲，投喂量以保持每毫升水體中的輪蟲數(shù)量為10個～20個為宜。30日齡后補充投喂鹵蟲無節(jié)幼體，60日齡后投喂鹵蟲無節(jié)幼體或配合飼料，投喂量以5min～10min吃完為宜，每天投喂2次。9DB44/TXXXX.1—2021附錄B諸氏鯔蝦虎魚馴養(yǎng)方法B.1馴養(yǎng)魚來源馴養(yǎng)魚應來源于人工繁育、同一批次、大小一致的諸氏鯔蝦虎魚群體。B.2馴養(yǎng)環(huán)境條件表B.1諸氏鯔蝦虎魚的馴養(yǎng)環(huán)境條件室內(nèi)自然光照或明暗時間比約為14h:10h，水面照度54B.3馴養(yǎng)時間幼成魚應馴養(yǎng)14d以上；仔魚孵出時開始馴養(yǎng)，至毒性試驗開始時結束馴養(yǎng)。B.4投喂按照A.4執(zhí)行。試驗前5h～24h停止喂食。B.5馴養(yǎng)魚的處理馴養(yǎng)魚不進行疾病處理。幼成魚馴養(yǎng)48h后，開始記錄死亡率，并按下述方法處