北大儀器分析-紫外可見分光光度法3

一、定性分析二、純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定三、單組分的定量方法四、同時(shí)測(cè)定多組分的定量方法——計(jì)算分光光度法五、結(jié)構(gòu)分析六、比色法第三節(jié)紫外-可見分光光度分析法一、定性分析（一）定性鑒別

定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目、位置（波長(zhǎng)）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)結(jié)構(gòu)完全相同的化合物完全相同的吸收光譜吸收光譜相同的化合物不一定是同一個(gè)化合物。方法:對(duì)比法

將樣品化合物的吸收光譜特征與標(biāo)準(zhǔn)化合物的吸收光譜特征進(jìn)行比較，或與文獻(xiàn)所載的紫外-可見標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)。

如果兩者完全相同，則可能是同一種化合物；如果兩者有明顯差別，則肯定不是同一種化合物續(xù)前1．對(duì)比吸收光譜的特征值續(xù)前2．對(duì)比吸光度或吸光系數(shù)的比值：

可消去濃度和厚度的影響（適于不只一個(gè)吸收峰的化合物）例：A1/A2=

E1Cl/E2Cl=E1

/E2

續(xù)前3．對(duì)比吸收光譜的一致性同一測(cè)定條件下，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物譜圖或標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照比較與文獻(xiàn)比較局限性:紫外吸收光譜一般只有一個(gè)或幾個(gè)寬吸收帶，曲線的形狀變化不多；不相同的化合物可以有很類似的甚至雷同的吸收光譜。得到相同的吸收光譜時(shí)，應(yīng)考慮到并非同一物質(zhì)的可能性；而在兩種純化合物的吸收光譜有明顯差異時(shí)，卻可以肯定兩物不是同一物質(zhì)。二、純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定1．純度檢查（雜質(zhì)檢查）1）峰位不重疊：

找λ→使主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收→直接考察雜質(zhì)含量光譜變形2）峰位重疊：主成分強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無吸收/弱吸收→與純品比較，E↓，A↓雜質(zhì)更強(qiáng)吸收＞＞主成分吸收→與純品比較，E↑，A↑，光譜變形2．雜質(zhì)的限量檢查規(guī)定：在某波長(zhǎng)下，A

不超過某值。藥物中的雜質(zhì)：制定一個(gè)允許其存在的限量（與分析誤差的存在相比較）

A<最大值

A

峰/A

谷

>最小允許值例：腎上腺素中微量雜質(zhì)——腎上腺酮含量計(jì)算用0.05mol/L的HCL配制成2mg/mL的溶液，λ310nm下測(cè)定。規(guī)定A310≤0.05即符合要求的雜質(zhì)限量≤0.06%三、單組分的定量方法

A=Cl

A~C（一定）線性注意要求：

選擇：吸收峰，大，A大，測(cè)定靈敏度高。幾個(gè)峰，選不易被其它物質(zhì)干擾的、較高吸收峰。不選光譜中靠短波長(zhǎng)末端的吸收峰。

溶劑的極限波長(zhǎng)：P209頁(yè)表11-3

吸收池：透光性定量依據(jù)：（一）吸收系數(shù)法（絕對(duì)法）

A=Cll，，

C=A/l

，手冊(cè)、文獻(xiàn)

例：維生素B12

的水溶液在361nm處的百分吸光系數(shù)為207，用1cm比色池測(cè)得某維生素B12溶液的吸光度是0.414，求該溶液的濃度（書P201例1）解：練習(xí)例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測(cè)定吸光度為0.507，求B12的百分含量？解：(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線法絕對(duì)法

A必須準(zhǔn)確

會(huì)在一定范圍內(nèi)變化

AC

會(huì)產(chǎn)生比較大誤差

A=ECl

=K?C

A

KC

線性續(xù)前標(biāo)準(zhǔn)曲線法

CACxAx0示例

蘆丁含量測(cè)定0.710mg/25mL（三）對(duì)照法同樣條件：、C標(biāo)、A標(biāo)、A樣C樣

A標(biāo)=EC標(biāo)

l

A標(biāo)/A樣=C標(biāo)/C樣

A樣=EC樣

l

C樣（%）=C標(biāo)?A樣/A標(biāo)續(xù)前注：當(dāng)樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋倍數(shù)相同時(shí)例：維生素B12的含量測(cè)定

精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對(duì)照液，精密稱定對(duì)照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測(cè)定A為0.508和0.518，求B12注射液注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量（該B12注射液的標(biāo)示量為100μg/mL）解：1）對(duì)照法2）吸光系數(shù)法四、多組分樣品的定量方法

——

計(jì)算分光光度法理論基礎(chǔ)吸光度加和性

續(xù)前1．兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量續(xù)前2．兩組分吸收光譜部分重疊

λ1→測(cè)A1→b組分不干擾→可按單組分定量測(cè)Caλ2→測(cè)A2→a組分干擾→不能按單組分定量測(cè)Ca

續(xù)前3．兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測(cè)定（1）解線性方程組法（2）等吸收雙波長(zhǎng)法（3）系數(shù)倍率法（4）三波長(zhǎng)法（5）導(dǎo)數(shù)光譜法（6）褶合光譜法（自學(xué)）（1）解線性方程組法

=+=?Ca+?Cb=+=?Ca+?Cb

可推論至任意多組分步驟：（2）等吸收雙波長(zhǎng)法適用性：可測(cè)混濁溶液；測(cè)吸收光譜重疊的混合組分；不需空白作參比靈敏度、精密度局限性：干擾組分的吸收光譜中至少需有一個(gè)吸收峰或谷。步驟：

消除a的影響測(cè)b消去b的影響測(cè)a注：須滿足兩個(gè)基本條件選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下干擾組分具有等吸收點(diǎn)選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下待測(cè)物的吸光度差值應(yīng)足夠大（3）系數(shù)倍率法前提：干擾組分b的吸收光譜呈陡坡形，沒有吸收峰，不成峰形，無等吸收點(diǎn)。雙波長(zhǎng)法

系數(shù)倍率法假設(shè)某一組分在選定兩個(gè)波長(zhǎng)

1和

2測(cè)得吸光度的比值為K

掩蔽系數(shù)

A1/A2=K（或A2/A1=K）

A=KA2

A1=0（或A=A2

KA1=0）續(xù)前步驟：b曲線上任找一點(diǎn)→λ1

另一點(diǎn)→λ2優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)將待測(cè)組分和干擾組分放大信號(hào)K倍，提高了待測(cè)組分測(cè)定靈敏度abλ1

λ2

A與待測(cè)組分Ca成正比系數(shù)倍率法K值：5~7倍波長(zhǎng)

2的吸光度值乘掩蔽系數(shù)K時(shí)干擾組分和待測(cè)組分都放大了K倍

A

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率

靈敏度

K值過大噪聲放大信噪比S/N減小影響測(cè)定（4）三波長(zhǎng)法選三個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)，

1、

2、

max，且三個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)必須在干擾組分的吸收光譜上為一條直線，根據(jù)相似三角形的等比性質(zhì)，可以推導(dǎo)出所測(cè)得的A1、A2、和Amax的關(guān)系式如下：

A=Amax

–（（A1–A2）+A2

）

=Amax

–=（Emax–）Cl

A~C正比，消除干擾（5）導(dǎo)數(shù)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法又稱微分光譜法吸收光譜波長(zhǎng)的函數(shù)

A=ECl

=C

?(

)它的導(dǎo)函數(shù)的圖像導(dǎo)數(shù)光譜

一階、二階、三階……吸收光譜（原函數(shù)）是一個(gè)難以給出具體形式的復(fù)雜函數(shù)導(dǎo)數(shù)光譜是一個(gè)逐點(diǎn)描繪而成的函數(shù)圖像。如圖：表示了近似高斯曲線的單一吸收曲線和它的一至四階導(dǎo)數(shù)曲線。導(dǎo)數(shù)光譜特別使用于痕量分析，重疊光譜的分離，吸收背景的消除，以及渾濁液、乳濁物的研究及鑒別。圖

吸收曲線及一至四階導(dǎo)數(shù)曲線

（A）導(dǎo)數(shù)光譜的波型和特點(diǎn)（A）導(dǎo)數(shù)光譜的波型和特點(diǎn)

零階光譜的極大在奇數(shù)階（n=1,3…）的導(dǎo)數(shù)中相應(yīng)于零.而在偶數(shù)階（n=2,4…）的導(dǎo)數(shù)中相應(yīng)于一個(gè)極值（極小和極大交替出現(xiàn)）。有助于對(duì)吸收曲線峰值的精確測(cè)定。圖吸收曲線及一至四階導(dǎo)數(shù)曲線

零階光譜上的拐點(diǎn)，在奇數(shù)階導(dǎo)數(shù)中產(chǎn)生極值，在偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)中為零。對(duì)肩峰的鑒別和分離。隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)增加，極值數(shù)目增加（極值數(shù)=導(dǎo)數(shù)階數(shù)+1）。譜帶寬度變小，分辨能力增高可分離和檢測(cè)兩個(gè)或兩個(gè)以上重疊的譜帶。在吸收光譜曲線上很微弱而不易辨別的特征，在導(dǎo)數(shù)光譜上有明顯的表現(xiàn)。

（突出矛盾）10ppm苯的乙醇液1ppm苯的乙醇液0ppm純乙醇1ppm苯的乙醇溶液，一階導(dǎo)數(shù)光譜基本光譜1ppm苯的乙醇溶液，四階導(dǎo)數(shù)光譜選擇性及靈敏度均提高（苯的導(dǎo)數(shù)信號(hào)）例：（B）導(dǎo)數(shù)光譜的定量原理

A=

Cl一階導(dǎo)數(shù)：dA/d

=d/d

?C

?l

二階導(dǎo)數(shù)：d2A/d

2=d2/d

2

?C

?l三階導(dǎo)數(shù)：d3A/d

3=d3/d

3

?C

?l在任意一波長(zhǎng)處，導(dǎo)數(shù)光譜的數(shù)值與濃度成正比。導(dǎo)數(shù)光譜用作定量的理論依據(jù)（C）導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)干擾吸收的消除

求導(dǎo)

冪函數(shù)降冪

消除干擾祥見講義（D）導(dǎo)數(shù)光譜法定量數(shù)據(jù)的測(cè)量導(dǎo)數(shù)信號(hào)與待測(cè)物的濃度成正比

測(cè)量方法代數(shù)法幾何法

（見P215圖11-24）

基線法峰-谷法峰-零法（正切法）

dpZ數(shù)值變動(dòng)引起導(dǎo)數(shù)光譜的變異很靈敏導(dǎo)數(shù)光譜定量需用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比的方法（標(biāo)準(zhǔn)品在選定條件下作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在相同條件下測(cè)樣品）導(dǎo)數(shù)峰高測(cè)量方法：測(cè)量方法有三，如下圖：正切法：相鄰峰(極大或極小)切線中點(diǎn)至相鄰峰切線(極小或極大)的距離d；峰谷法：兩相鄰峰值(極大或極小)間的距離p1或p2；峰零法：極值峰至零線間的距離。例：四階導(dǎo)數(shù)法測(cè)定新康泰克膠囊中鹽酸偽麻黃堿的含量定量分析方法總結(jié)定量分析

吸收系數(shù)法

A=E

C

l對(duì)照法

雙波長(zhǎng)法解線性方程組法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法導(dǎo)數(shù)光譜法系數(shù)倍率法褶合光譜法五、有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)分析有機(jī)化合物的紫外吸收光譜飽和碳?xì)浠衔锖铝⒅珗F(tuán)和生色團(tuán)的飽和有機(jī)化合物共軛烯烴

、不飽和酮、醛、酸和酯芳香族化合物有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的研究(一)有機(jī)化合物的紫外吸收光譜

1.飽和碳?xì)浠衔?/p>

吸收峰在真空紫外區(qū)

200~400nm沒吸收紫外吸收光譜分析中作溶劑2.含孤立助色團(tuán)和生色團(tuán)的飽和有機(jī)化合物(1)飽和碳?xì)浠衔铩狧

取代

O、N、S、X（n）

n

吸收峰長(zhǎng)移

P209頁(yè)表10-5含有雜原子的飽和化合物的吸收峰（2）孤立生色團(tuán)化合物

n

、n

、

n

，190nm

三個(gè)吸收峰

，160~180nm

n

，275~295nm孤立生色團(tuán)：

，，，，

，，，P209表10-6一些孤立生色團(tuán)的最大吸收峰3.共軛烯烴

共軛，大鍵，

max長(zhǎng)移，

max

不變，

共軛體系，h

，

max

，

。4.

、不飽和酮、醛、酸和酯

（共軛）

n

n

200~260nm

310~350nm200nm280nm104<1005.芳香族化合物苯和取代苯助色團(tuán)取代生色團(tuán)取代芳雜環(huán)化合物(1)苯和取代苯苯最簡(jiǎn)單的芳香族化合物環(huán)狀共軛體系紫外光區(qū)：E1帶、E2帶、B帶

max204nmmax256nm

芳香族化合物特征：它的精細(xì)結(jié)構(gòu)在極性溶劑中消失當(dāng)苯環(huán)上有取代基時(shí)，苯的三個(gè)吸收帶長(zhǎng)移，

助色團(tuán)取代孤對(duì)電子的雜原子n

共軛

E2、B帶長(zhǎng)移，

孤對(duì)電子，n

共軛

判斷是否存在

E2、B帶長(zhǎng)移，

失去孤對(duì)電子，n

共軛消失判斷是否存在吸收帶與苯相似生色團(tuán)取代200~250nmK帶

>104

B帶長(zhǎng)移

K帶B帶R帶苯––；

255nm；215

苯乙烯244nm；12,000282nm；450

苯甲醛

244nm；15,000280nm；1,500328nm；20（2）芳雜環(huán)化合物飽和五元環(huán)、六元環(huán)吸收峰波長(zhǎng)<200nm不飽和五元環(huán)：n電子，參加雜環(huán)共軛。無n

躍遷不飽和六元環(huán)：N雜環(huán)芳烴相似

B帶強(qiáng)度，精細(xì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化、消失。（二）有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的研究單獨(dú)用紫外光譜不能完全確定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

輔助作用

（與IR、MS、NMR配合）分子骨架共軛關(guān)系，共軛體系中取代基種類……1.從吸收光譜中初步推斷官能團(tuán)220~800nm，無吸收（

<1）脂肪族飽和碳?xì)浠衔?/p>

胺、腈、醇、醚、羧酸、氯化烴、氟化烴

無共軛體系，無、。210~250nm，吸收帶

兩個(gè)共軛單位260~300nm，強(qiáng)吸收帶

3~5個(gè)共軛單位250~300nm，弱吸收帶

羰基存在250~300nm，中等強(qiáng)度吸收帶

苯環(huán)振動(dòng)結(jié)構(gòu)400~800nm，化合物有顏色

共軛生色團(tuán)5個(gè)以上

2.異構(gòu)體的推定(自學(xué))

3.化合物骨架的推定未知化合物與已知化合物的紫外吸收光譜一致時(shí)，可以認(rèn)為兩者具有同樣的發(fā)色團(tuán)。推定化合物骨架未知化合物的紫外光譜若與已知標(biāo)準(zhǔn)化合物（對(duì)照品）一致,則可能是同一種化合物。未知化合物的紫外光譜若與已知標(biāo)準(zhǔn)化合物（對(duì)照品）不一致,則肯定不是同一種化合物。六、光電比色法可見分光光度法對(duì)于能吸收可見光的有色溶液的測(cè)定方法，通常稱為光電比色法。不吸收可見光有色物質(zhì)顯色反應(yīng)及其條件測(cè)定方法沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)（一）顯色反應(yīng)及影響因素金屬離子配位體絡(luò)離子

105

靈敏度高有色產(chǎn)物有機(jī)溶劑萃取比色顯色反應(yīng)及影響因素a.反應(yīng)選擇性好顯色劑盡可能不要與溶液中其他共存離子顯色b.靈敏度高

(反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)足夠大ε>104)但靈敏度高不一定選擇性好。在實(shí)踐中應(yīng)全面考慮c.確定的定量關(guān)系，A

被測(cè)物的含量。被測(cè)物質(zhì)生成的有色物質(zhì)d.產(chǎn)物（顯色物）穩(wěn)定（化學(xué)組成、化學(xué)性質(zhì)），A重現(xiàn)e.反應(yīng)物和產(chǎn)物有明顯的顏色差別

(

l>60nm)1.顯色反應(yīng)的要求絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2.顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)

褪色反應(yīng)：

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)：達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色3.顯色劑無機(jī)顯色劑:

過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類：三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫

鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4.影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變?chǔ)

所用的顯色劑不少是有機(jī)弱酸（以HR表示）

影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀

影響絡(luò)合物組成（配位數(shù)的改變）形式pH