《CR及質(zhì)粒提取》課件

CR及質(zhì)粒提取CR和質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見的技術(shù)。CR是指限制性內(nèi)切酶，可以識(shí)別特定的DNA序列并將其切割，而質(zhì)粒提取則是從細(xì)菌中分離出質(zhì)粒DNA的過程。這兩項(xiàng)技術(shù)在基因克隆、基因工程等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。課程目的掌握基因工程基本理論深入理解基因工程的核心概念，包括基因克隆、基因表達(dá)和基因編輯等。熟練掌握CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)了解CRISPR-Cas9系統(tǒng)的原理，并掌握其在基因編輯實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。學(xué)習(xí)質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)化技術(shù)掌握質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)化操作流程，并能夠獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。提升實(shí)驗(yàn)操作技能培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度，提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析能力。基因工程概覽基因工程是一門利用生物技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行改造和操作的學(xué)科。它涉及對(duì)基因的克隆、表達(dá)、修飾和轉(zhuǎn)移等操作?；蚬こ淘谏镏扑?、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。基因工程的應(yīng)用主要集中在以下幾個(gè)方面：生產(chǎn)藥物和疫苗，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，培育抗病蟲害的作物，改善環(huán)境污染等?；蚬こ讨械闹匾拍钕拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別特定DNA序列，并在這些序列中切割DNA。DNA連接酶將DNA片段連接在一起，形成新的DNA分子。載體將外源基因傳遞到宿主細(xì)胞中的工具，例如質(zhì)?；虿《尽？寺⑻囟ɑ驈?fù)制并擴(kuò)增，以獲得大量相同的基因拷貝。什么是質(zhì)粒小型環(huán)狀DNA存在于細(xì)菌等微生物中，獨(dú)立于染色體之外。復(fù)制能力能夠自主復(fù)制，并且在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。攜帶基因可以攜帶特定的基因，例如抗生素抗性基因，可以表達(dá)并賦予細(xì)菌特定功能?；蚬こ虘?yīng)用在基因工程中，質(zhì)?？勺鳛檩d體，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的環(huán)狀DNA分子。典型質(zhì)粒包含復(fù)制起點(diǎn)（ori）、選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因）和多克隆位點(diǎn)（MCS），MCS用于插入外源基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)11.自復(fù)制質(zhì)粒能夠獨(dú)立于宿主染色體進(jìn)行自我復(fù)制，確保每個(gè)子代細(xì)菌都繼承一個(gè)拷貝的質(zhì)粒。22.穩(wěn)定遺傳質(zhì)粒能夠穩(wěn)定地遺傳給子代細(xì)菌，確保遺傳信息的持久保存。33.可轉(zhuǎn)移一些質(zhì)?？梢詮囊粋€(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，有利于基因的傳播和擴(kuò)散。44.可切割質(zhì)粒的DNA可以被限制性內(nèi)切酶切割，方便基因的插入和構(gòu)建重組質(zhì)粒。質(zhì)粒的作用基因克隆載體質(zhì)?？勺鳛榛蚩寺≥d體，將目的基因插入質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)基因的復(fù)制和表達(dá)。蛋白表達(dá)載體質(zhì)?？勺鳛榈鞍妆磉_(dá)載體，控制目的基因的表達(dá)，進(jìn)行蛋白生產(chǎn)和研究?？股乜剐曰蛸|(zhì)粒可攜帶抗生素抗性基因，用于篩選含有質(zhì)粒的細(xì)菌，方便克隆操作。熒光蛋白表達(dá)載體質(zhì)?？蓴y帶熒光蛋白基因，用于構(gòu)建熒光標(biāo)記細(xì)胞，便于觀察和研究細(xì)胞活動(dòng)。質(zhì)粒的獲取途徑購買從專業(yè)的生物試劑公司購買現(xiàn)成的質(zhì)粒，方便快捷，但也可能存在價(jià)格昂貴和質(zhì)量不穩(wěn)定的問題。提取從已有的菌株中提取質(zhì)粒，可以節(jié)省成本，但也需要掌握相應(yīng)的技術(shù)和設(shè)備。構(gòu)建根據(jù)研究需要，構(gòu)建新的質(zhì)粒，需要使用分子克隆技術(shù)，涉及到基因的連接、酶切、連接等操作。感受態(tài)細(xì)胞的制備1準(zhǔn)備細(xì)菌選擇合適的菌株，如大腸桿菌2培養(yǎng)細(xì)菌在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期3處理細(xì)菌用CaCl2溶液處理，使細(xì)胞膜變得更透性4冰浴保存將處理后的細(xì)菌置于冰浴中，保持其活性感受態(tài)細(xì)胞是指細(xì)菌在特殊處理后，細(xì)胞膜變得更容易接受外源DNA的細(xì)胞。通過制備感受態(tài)細(xì)胞，可以提高基因轉(zhuǎn)化的效率。感受態(tài)細(xì)胞與外源DNA的結(jié)合感受態(tài)細(xì)胞是指經(jīng)特殊處理，使其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性增加，能夠攝取外源DNA的細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞與外源DNA混合后，外源DNA可以通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。1DNA結(jié)合外源DNA與感受態(tài)細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合2細(xì)胞膜穿透DNA通過細(xì)胞膜上的孔隙進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)3整合到染色體外源DNA整合到細(xì)菌染色體上4復(fù)制擴(kuò)增外源DNA在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增熱休克法轉(zhuǎn)化原理1感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)過特殊處理的細(xì)菌細(xì)胞，能夠吸收外源DNA。2冰浴將感受態(tài)細(xì)胞與外源DNA混合后，在冰浴中短暫孵育，使DNA結(jié)合到細(xì)胞表面。3熱休克將冰浴后的混合物轉(zhuǎn)移至42℃水浴中，短暫熱休克，促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。4恢復(fù)熱休克后，將混合物轉(zhuǎn)移至冰浴中恢復(fù)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生理狀態(tài)。5培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有抗生素的培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能在抗生素存在下生長繁殖。熱休克法轉(zhuǎn)化操作步驟準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，確保細(xì)胞活性。加入外源DNA將已準(zhǔn)備好的外源DNA加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混合，避免過度震蕩。熱休克處理將混合物轉(zhuǎn)移到42℃水浴中，進(jìn)行短暫的熱休克處理，促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞?；謴?fù)培養(yǎng)將熱休克后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冰上，加入培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞恢復(fù)生長，表達(dá)外源基因。電穿孔法轉(zhuǎn)化原理1細(xì)胞膜電穿孔在高壓電場作用下，細(xì)胞膜發(fā)生短暫的穿孔，形成可逆的通透性改變。2DNA進(jìn)入細(xì)胞外源DNA通過穿孔的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞染色體結(jié)合，并整合到宿主細(xì)胞基因組中。3細(xì)胞修復(fù)電穿孔后，細(xì)胞膜迅速修復(fù)，恢復(fù)正常功能，并開始表達(dá)外源基因。電穿孔法轉(zhuǎn)化操作步驟1準(zhǔn)備制備感受態(tài)細(xì)胞，配制電穿孔緩沖液。2混合將感受態(tài)細(xì)胞與外源DNA混合。3電穿孔將混合物置于電穿孔儀中進(jìn)行電脈沖處理。4恢復(fù)電穿孔后，將細(xì)胞置于恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)。5涂板將恢復(fù)后的細(xì)胞涂布于含有抗生素的培養(yǎng)基上。電穿孔法是將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的一種高效方法。通過電脈沖處理，細(xì)胞膜暫時(shí)變?yōu)橥ㄍ福试S外源DNA進(jìn)入。電穿孔法比傳統(tǒng)的熱休克法效率更高，但操作步驟更為復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制溫度、電壓和時(shí)間等參數(shù)。質(zhì)粒提取技術(shù)概述1分離純化從宿主細(xì)胞中分離出質(zhì)粒，并去除細(xì)胞碎片和污染物。2去除雜質(zhì)去除宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)、RNA和其他雜質(zhì)，獲得高純度的質(zhì)粒。3濃縮定量濃縮質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行定量分析，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。堿裂解法提取質(zhì)粒1細(xì)菌裂解利用堿性溶液破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜2質(zhì)粒分離利用離心分離質(zhì)粒DNA和細(xì)菌染色體DNA3質(zhì)粒沉淀利用乙醇沉淀純化質(zhì)粒DNA4質(zhì)粒溶解將質(zhì)粒DNA溶解于緩沖液中堿裂解法是一種簡單高效的質(zhì)粒提取方法，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究。該方法利用堿性溶液破壞細(xì)菌細(xì)胞，使質(zhì)粒DNA與細(xì)菌染色體DNA分離，然后利用乙醇沉淀純化質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取質(zhì)粒步驟細(xì)菌培養(yǎng)將含有質(zhì)粒的細(xì)菌在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。收集細(xì)菌通過離心將細(xì)菌沉淀下來，去除培養(yǎng)基。溶解細(xì)菌使用溶液Ⅰ將細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜溶解，釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，包括質(zhì)粒DNA。堿裂解使用溶液Ⅱ，使細(xì)菌的染色體DNA變性，而質(zhì)粒DNA保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)。中和使用溶液Ⅲ中和堿性溶液，使染色體DNA重新折疊成不溶性狀態(tài)，而質(zhì)粒DNA則保持溶解狀態(tài)。離心通過離心去除不溶性的染色體DNA，留下上清液，其中含有質(zhì)粒DNA。乙醇沉淀使用乙醇將質(zhì)粒DNA從溶液中沉淀下來，并通過離心收集。洗滌用70%的乙醇洗滌沉淀的質(zhì)粒DNA，去除殘留的鹽和其他雜質(zhì)。干燥將質(zhì)粒DNA沉淀干燥，去除殘留的乙醇。溶解將干燥的質(zhì)粒DNA溶解在合適的緩沖液中，即可獲得純化的質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒的方法柱層析法利用不同物質(zhì)在層析介質(zhì)上的吸附能力差異，分離純化質(zhì)粒。超速離心法利用不同分子大小和密度的差異，通過高速離心分離純化質(zhì)粒。凝膠電泳法利用電場中帶電分子的遷移速度差異，分離純化質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的技術(shù)，用于分離和分析不同大小的DNA分子。通過觀察質(zhì)粒在凝膠中的遷移距離，可以確定其大小和純度。電泳結(jié)果可以用于評(píng)估質(zhì)粒提取的效率和質(zhì)量，還可以幫助分析質(zhì)粒的完整性。限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒1酶切位點(diǎn)選擇合適的限制性內(nèi)切酶2酶切反應(yīng)按照酶切反應(yīng)條件進(jìn)行操作3電泳檢測確認(rèn)酶切是否成功4目標(biāo)片段提取目標(biāo)片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒是基因工程中常見的操作，可用于構(gòu)建重組質(zhì)粒、分析質(zhì)粒結(jié)構(gòu)等。電泳分析酶切結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳將酶切后的質(zhì)粒樣本加載到凝膠上，并在電場中運(yùn)行，根據(jù)分子大小分離DNA片段。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)使用已知大小的DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)，確定未知片段的大小。結(jié)果分析分析電泳結(jié)果，確定酶切是否成功，并評(píng)估質(zhì)粒的完整性。蛋白酶K消化細(xì)菌載體1裂解細(xì)菌細(xì)胞蛋白酶K是一種廣譜蛋白酶，能夠有效消化細(xì)菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，包括細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜蛋白。2釋放質(zhì)粒DNA蛋白酶K消化細(xì)菌載體后，能夠釋放出質(zhì)粒DNA，便于后續(xù)的質(zhì)粒提取和純化操作。3提高質(zhì)粒提取效率通過消化細(xì)菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，能夠減少提取過程中對(duì)質(zhì)粒DNA的干擾，提高質(zhì)粒提取的效率和純度。乙醇沉淀法濃縮質(zhì)粒添加乙醇在提取的質(zhì)粒溶液中加入適量的無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70%左右，使質(zhì)粒DNA從溶液中析出。低溫沉淀將混合液置于-20℃冰箱中沉淀1小時(shí)以上，使質(zhì)粒DNA沉淀更加完全。離心收集將混合液離心，將沉淀的質(zhì)粒DNA收集在離心管底部。清洗沉淀用70%的乙醇清洗沉淀，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)，以提高質(zhì)粒DNA的純度。干燥沉淀將沉淀干燥，去除殘留的乙醇，可使用真空干燥或自然干燥。溶解質(zhì)粒將干燥的質(zhì)粒DNA溶解在合適的緩沖液中，例如TE緩沖液，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存。濃縮質(zhì)粒的定量分析NanoDrop和熒光定量法是兩種常用的方法，用于分析濃縮質(zhì)粒的濃度。NanoDrop可以提供快速的結(jié)果，但對(duì)于低濃度的樣本可能不太準(zhǔn)確。熒光定量法更加靈敏，但需要使用專門的試劑和儀器。質(zhì)粒的儲(chǔ)存與保存低溫保存將質(zhì)粒溶液儲(chǔ)存在-20℃或-80℃的冰箱中，可以有效減緩質(zhì)粒降解，延長保存時(shí)間。避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融會(huì)破壞質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，降低其活性，因此應(yīng)盡量避免。添加甘油添加一定濃度的甘油可以降低溶液冰點(diǎn)，保護(hù)質(zhì)粒在冷凍過程中不被破壞。定期檢測建議定期對(duì)保存的質(zhì)粒進(jìn)行檢測，確保其質(zhì)量和活性，以便及時(shí)采取措施。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響因素細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞的生長狀態(tài)會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。健康、活力的細(xì)胞更容易吸收外源DNA。質(zhì)粒濃度高濃度的質(zhì)粒能提高轉(zhuǎn)化效率，因?yàn)槟茉黾油庠碊NA進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會(huì)。轉(zhuǎn)化方法不同的轉(zhuǎn)化方法，如熱休克法或電穿孔法，具有不同的效率。抗生素選擇壓力選擇合適的抗生素濃度可以篩選出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)化效率。質(zhì)粒提取中的注意事項(xiàng)潔凈操作保持無菌操作，避免污染。試劑準(zhǔn)備確保試劑新鮮，避免降解。溫度控制嚴(yán)格控制操作溫度，避免降解。操作速度迅速進(jìn)行操