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文檔簡介

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則(一)保持實(shí)驗(yàn)室安靜,認(rèn)真仔細(xì)地按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(二)穿戴好實(shí)驗(yàn)服。保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清潔整齊。(三)愛護(hù)儀器,謹(jǐn)慎使用。節(jié)約使用藥品試劑,蒸餾水,自來水和電。(四)不得將高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、有毒污垢物品拋灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。(五)公用物品用畢放回原處,不得私自占有。(六)取完試劑應(yīng)將瓶蓋蓋好,切勿錯(cuò)蓋,用畢放回原處。(七)加熱、用電,使用劇毒腐蝕試劑應(yīng)注意安全操作,避免事故。(八)廢棄液體除指定有專門容器收集者外,應(yīng)倒入水池,并放水沖走,固體廢物倒入廢物缸內(nèi)。動(dòng)物尸體應(yīng)放入指定的容器中。(九)實(shí)驗(yàn)過程中自己不能解決或決定的問題,切勿盲目處理,應(yīng)及時(shí)向指導(dǎo)教師反映取得幫助。(十)實(shí)驗(yàn)完畢,須將試劑排列整齊,整理好公用物品,將儀器洗凈收起。檫凈實(shí)驗(yàn)臺(tái),請(qǐng)指導(dǎo)教師檢查,允許后方可離開。實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及記錄,按照下列順序?qū)懗鰧?shí)驗(yàn)報(bào)告:實(shí)驗(yàn)報(bào)告首頁:實(shí)驗(yàn)名稱(Thetitleofexperiment);姓名;學(xué)號(hào);班級(jí);組別;同組同學(xué);帶教教師;實(shí)驗(yàn)日期等。正文:①原理(Principle);②操作步驟(Operationalprocedure);③實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Results):包括照片、原始數(shù)據(jù)、計(jì)算過程及圖表等;④討論(Discussion):對(duì)實(shí)驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果和異?,F(xiàn)象進(jìn)行探討和評(píng)論,以及對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議。成績?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)50%實(shí)驗(yàn)+50%理論考試實(shí)驗(yàn)課8次,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)(包括遲到早退,著裝規(guī)范,實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范,實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生值日等),8次實(shí)驗(yàn)總分最后按比例計(jì)入總成績。實(shí)驗(yàn)報(bào)告存檔,不歸還。理論考試內(nèi)容來自于講義及平時(shí)教學(xué)。

第八次設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課安排分組方案:4人一組(無法組隊(duì)同學(xué)加入其它組)答辯ppt內(nèi)容:實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,意義,原理,實(shí)驗(yàn)方法選擇,預(yù)計(jì)結(jié)果及數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式,實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)及可能出現(xiàn)問題,可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差及解釋答辯安排:最后一周答辯,每組時(shí)間控制為20分鐘演講,10分鐘提問。

設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)題1免疫球蛋白IgG的分離純化與鑒定。2人血清白蛋白的提取純化及分子量的測(cè)定。3蛋清中溶菌酶的分離鑒定。4小鼠肝臟過氧化氫酶的分離純化及酶動(dòng)力學(xué)研究。5如何從動(dòng)物心肌細(xì)胞中提取乳酸脫氫酶同工酶?6如何提取真核細(xì)胞中的線粒體基因組DNA?7請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從基因及蛋白表達(dá)角度討論老年癡呆癥模型小鼠與人類老年癡呆癥的可比較性(即小鼠模型建立的可靠性)

8請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從基因及蛋白表達(dá)角度追蹤老年癡呆模型小鼠發(fā)病期典型變化,及給藥治療后效果評(píng)價(jià)

9蛋白質(zhì)的表達(dá)具有一定的組織特異性,請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺和肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidaseA1)和白蛋白(Albumin)并計(jì)算這兩種蛋白質(zhì)在胰腺和肝臟中的表達(dá)量。10細(xì)胞色素氧化酶(Cytochrome

oxidase)在肝臟中有三種亞型,即細(xì)胞色素氧化酶1,2和3,請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這三種酶的表達(dá)并計(jì)算它們的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)一、真核生物基因組DNA的提取和含量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)背景高等生物的基因組很大。比如人細(xì)胞基因組約含3萬個(gè)結(jié)構(gòu)基因?;蚪M包含了人生長,發(fā)育,繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息量。研究的起點(diǎn)就是要獲得高純度基因組DNA-不含蛋白質(zhì)、糖類、酚、氯仿等污染;得率好-以便有足夠量用于分析;基因組相對(duì)完整-不斷裂的基因組以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文庫的構(gòu)建,基因探測(cè)等的研究。人體一個(gè)細(xì)胞基因組DNA有多長度?人基因組有多大?人體有多少細(xì)胞?掌握小鼠肝臟基因組DNA的提取技術(shù)學(xué)習(xí)DNA定性、定量分析的原理和技術(shù)第一部分:小鼠肝組織DNA的提取第二部分:紫外分光光度法分析DNA純度第三部分:二苯胺法分析DNA含量和純度三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

四、主要試劑二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

五、實(shí)驗(yàn)步驟一、核酸提取的主要步驟真核細(xì)胞基因組在提取過程中一般有以下幾步:1)破碎細(xì)胞2)去除蛋白質(zhì),糖類等等生物大分子;由于真核細(xì)胞基因組較大,在純化出的DNA的操作中應(yīng)注意動(dòng)作輕柔,且在低溫下進(jìn)行,以最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切,從而獲得相對(duì)完整的DNA3)沉淀核酸乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化二苯胺法紫外分光光度法分析DNA提取和分析步驟圖解酚氯仿抽提作用:a.陰離子型去污劑,溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分

b.使蛋白質(zhì)變性

c.將細(xì)胞膜、核膜破壞;對(duì)核酸酶有抑制作用成分:N:NaCl150mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)

作用:金屬離子螯合劑,抑制DNase的活性

(螯合DNase發(fā)揮活性所需的2價(jià)陽離子)。

二、各種試劑的作用1、裂解液:2、SDS:十二烷基硫酸鈉終濃度0.5%3、蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)作用:廣譜蛋白酶,能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性,降解蛋白質(zhì),將DNA游離。重蒸酚:酚的作用是變性蛋白質(zhì),而對(duì)DNA結(jié)構(gòu)沒有影響。無色酚的氧化產(chǎn)物(如醌等,粉紅色)破壞磷酸二脂鍵。重蒸酚是將酚中的酚的氧化產(chǎn)物去除。TE溶液:Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)

作用:提供略堿的pH值,保證DNA溶于水相。在酸性條件下,DNA分配于有機(jī)相。8-羥基喹啉:0.1%黃色酚相指示劑抗氧化劑作用:去除蛋白等雜質(zhì)。酚對(duì)蛋白有強(qiáng)烈的變性作用,可使樣品中的蛋白質(zhì)變性,通過離心去除。為防止其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響,一般再用氯仿抽提去除殘留的酚。4、苯酚:成分:氯仿作用:

a.氯仿的變性作用不如酚好,

但與酚共同/交替使用可增強(qiáng)去蛋白效果;

b.氯仿有加速有機(jī)相和水相的分離、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性;5、酚/氯仿6、氯仿/異戊醇(24:1)氯仿的作用:去除DNA水溶液中殘留的微量酚。異戊醇的作用:降低表面張力,減少操作過程中氣泡的產(chǎn)生。在單價(jià)陽離子存在的情況下,乙醇可以使DNA發(fā)生沉淀。8、無水乙醇:作用:提供單價(jià)陽離子,中和DNA分子表面的負(fù)電荷,使得DNA容易聚集7、醋酸鈉:3MNaAcpH:5.2核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物,能與很多陽離子形成鹽類而沉淀,在許多種有機(jī)溶劑中不溶解,也不會(huì)被變性。最常用沉淀劑為1價(jià)鈉、鉀、胺和鋰等離子的鹽類,如醋酸鈉、NaCl、氯化鋰、氯化鉀等常用有機(jī)沉淀劑有:乙醇、異丙醇、聚乙二醇、精胺等

注意事項(xiàng):1)本實(shí)驗(yàn)將用到的TE飽和重蒸苯酚、氯仿/異戊醇是有機(jī)試劑,比水的比重大,而DNA溶解在水里,我們總是取上清。;2)在抽取完苯酚、氯仿等有機(jī)試劑,不能將加樣器平放或倒置,以防液體導(dǎo)流損壞加樣器,加完樣后立即棄掉加樣器頭。。3)

基因組DNA由于太大,非常容易受機(jī)械剪切而斷裂,因此,為了得到完整的基因組DNA,盡量不要多次進(jìn)行物理性操作。4)離心機(jī)使用注意平衡?。?!【操作步驟】基因組DNA的提取1.組織細(xì)胞的裂解(1)切取0.2g鼠肝,冰冷生理鹽水洗3次。當(dāng)組織離開機(jī)體,DNA酶就會(huì)表現(xiàn)出活性。在冰冷的生理鹽水中,可以降低DNA酶的活性,防止基因組DNA被降解。(2)碎鼠肝轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中,加入2mL分離緩沖液,勻漿(冰上操作)。(3)勻漿液轉(zhuǎn)入2mL離心管,4℃,5000rpm離心5min;沉淀加0.4mL無菌水,吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液(含100μg/ml的蛋白酶K),慢慢顛倒混勻,50℃保溫90分鐘,直到組織完全解體。(4)加10mg/ml的RNase16μl(終濃度200μg/ml),37℃保溫40min。2.裂解物中蛋白質(zhì)的去除(1)加等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),慢慢顛倒混勻,冰上靜置5min。待分層后,于4℃,12000rpm離心15min。離心后可見分層,上層為水相含DNA,下層為有機(jī)溶劑層,變性蛋白質(zhì)介于兩層之間。(2)小心吸出上面的水層并轉(zhuǎn)移到新的小離心管中,根據(jù)吸出的量再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),重復(fù)上述操作以去除蛋白質(zhì),直至界面不再出現(xiàn)明顯的變性蛋白質(zhì)為止。(3)小心吸出上面的水層并轉(zhuǎn)移到另一新的小離心管中,根據(jù)吸出的量再加入等體積氯仿/異戊醇,慢慢顛倒混勻。4℃,12000rpm離心15min。本步驟可去除微量的酚。

3.DNA的沉淀

1)上清加1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10分鐘,DNA沉淀形成白色絮狀物。10000rpm離心10min,棄上清。

2)DNA沉淀溶解于3mlTE中,進(jìn)行260nm/280nm紫外檢測(cè)。核酸定性定量檢測(cè)

核酸的含量可以用定磷法、定糖法和紫外分光光度法來測(cè)定。定磷法是利用核酸分子中磷的含量相對(duì)恒定這一性質(zhì)來測(cè)定核酸的含量,該法測(cè)定的結(jié)果較準(zhǔn)確(RNA、DNA中磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值分別為9.5%,9.9%);定糖法中的二苯胺法測(cè)定DNA的含量紫外分光光度法測(cè)定核酸較為方便,但誤差較大。二苯胺顯色法測(cè)定DNA含量【基本原理】DNA在酸性條件下加熱,酸解釋出脫氧核糖。脫氧核糖在酸性環(huán)境中脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛,后者與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng),在595nm處有最大吸收。在反應(yīng)液中加入少量乙醛,可以提高反應(yīng)靈敏度。除脫氧核糖外,脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類,包括核糖在內(nèi),一般無此反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)流程DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液取14支試管,分成7組,其中五組依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mL

DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液用于繪制DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)流程DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液H2O水待測(cè)DNA溶液另取2支試管,各加2mL蒸餾水作為對(duì)照。2支試管,加2ml待測(cè)DNA溶液用于繪制DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)流程二苯胺DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液H2O水待測(cè)DNA溶液然后各加入4mL二苯胺試劑,混勻用于繪制DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線于100℃恒溫水浴中保溫20分鐘,冷卻后于595nm處進(jìn)行比色測(cè)定。取兩管平均值,以DNA含量為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNA含量的計(jì)算

根據(jù)測(cè)得的光吸收值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光吸收值的DNA的含量。紫外吸收法測(cè)定基因組DNA的含量及純度【基本原理】1.紫外分光光度法測(cè)定核酸含量:由于DNA在260nm處有最大的吸收峰,因此,可以用260nm波長進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度,吸光度A值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA。

2.紫外分光光度法測(cè)定DNA純度:由于DNA在260nm處有最大的吸收峰,而蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰。DNA純品的A260/A280為1.8(1.7~1.9),故根據(jù)算A260/A280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說明含有RNA,比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在?!静僮鞑襟E】1.用TE緩沖液稀釋樣品(5~20倍),2.用TE緩沖液調(diào)零點(diǎn),樣品稀釋液轉(zhuǎn)入紫外分光光度計(jì)的石英比色杯中,分別測(cè)定其在260nm和280nm的吸光度。吸光度在0.2~1.2OD范圍內(nèi)較為理想。3.計(jì)算濃度:雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=A260×核酸稀釋倍數(shù)×50/10004.計(jì)算A260/A280比值,分析純度。移液器的使用及注意事項(xiàng)1、用途2、使用2.1根據(jù)取樣量,選擇合適的加樣器。5ul、50ul、500ul,應(yīng)選擇哪個(gè)加樣器?頂部標(biāo)有加樣器的最大量程,分別為:20ul:

0.5~

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