HPLC及HPLCMS分析方法的開發(fā)及其在藥物分析中的應用

HPLC及HPLC/MS分析措施的開發(fā)及其在藥物分析中的應用基于分離分析科學技術小顆粒填料的色譜柱以光譜、質譜技術作為檢測手段專屬性、分離效率及敏捷度合用于廣泛的色譜應用合用于開發(fā)新措施合用于既有措施的改善HPLC及HPLC/MS法2質量源于設計（QualitybyDesign，QbD）準則試驗設計措施學（DesignofExperiment，DoE）措施驗證（MethodValidation）：保證措施在樣品分析的一定范圍內中精確、重現(xiàn)、可靠、耐用性。分析措施學的開發(fā)及驗證3措施開發(fā)試驗室獲得措施及運用過程措施驗證措施確認措施轉移精確度，精密度，專屬性，檢測限，定量限，線性，范圍，耐用性分析條件的篩選（色譜柱,流動相,pH等）及優(yōu)化（梯度、柱溫、流速等）法定檢查措施在使用環(huán)境中合用性評估（人員、儀器、樣品、試劑）非法定檢查措施在試驗室之間傳遞的文獻化過程4試驗室獲得措施及運用過程措施驗證措施確認-用一種性質明確的物質來挑戰(zhàn)建立的分析措施用一種確定措施來挑戰(zhàn)現(xiàn)實的分析環(huán)境專屬性，精確度，精密度，LOD，LOQ一般不需要進行線性，范圍，耐用性試驗5ICH、USP<1225>、ChPIIAppendixXIXA措施驗證的內容精確度（Accuracy）精密度（Precision）-反復性，重現(xiàn)性，中檢精密度專屬性（Specificity）檢測限（LOD）定量限（LOQ）線性（Linearity）范圍（Range）耐用性（Robustness）6措施驗證-系統(tǒng)合用性系統(tǒng)合用性試驗的內容在分析未知樣品之前或期間，檢查系統(tǒng)以保證系統(tǒng)之性能到達規(guī)定的規(guī)定塔板數(shù)，拖尾因子，分離度確定重現(xiàn)性（%RSD）系統(tǒng)合用性“樣品”主組份與預期副產(chǎn)物之混合物系統(tǒng)合用性試驗是色譜措施的一部分7措施驗證-系統(tǒng)合用性容量因子k'>2精密度/進樣反復性RSD1%,n5分離度Rs2(主峰與近來洗脫的色譜峰之間)拖尾因子T2理論塔板數(shù)一般N>8措施驗證-USP<1225>類型1主組份或活性成分定量分析措施類型2雜質或降解化合物測定措施類型3性能特點之確定分析措施如溶出度試驗類型4鑒別試驗9措施驗證-USP<1225>驗證的內容類型1定量

限度試驗類型3類型4鑒別試驗準確度++**-精密度++-+-專屬性+++*+檢測限--+*-定量限-+-*-線性++-*-范圍++**-類型2*也許需要，詳細與特定試驗的性質有關。10怎樣進行措施驗證分析試驗階段按照規(guī)定的試驗計劃或環(huán)節(jié)一般需要3到5天在不一樣操作條件下，進不一樣濃度的試樣原料及制劑皆需分析數(shù)據(jù)分析階段對分析成果進行記錄學計算色譜成果是相對的用記錄學分析的措施，可以客觀地評估最終止果的真實變化11措施驗證環(huán)節(jié)線性Day1-3定量限檢測限試驗參數(shù)2Min&Max耐用性試驗參數(shù)3Min&Max試驗參數(shù)4Min&Max六次空白樣品的基線噪音定量限精密度定量限原料藥濃度4原料藥濃度3原料藥濃度2原料藥濃度1原料藥濃度5原料藥精密度1-3天六次反復,100%原料藥試驗參數(shù)1Min&Max濃度4:120%原料及制劑濃度3:100%原料及制劑濃度2:80%原料及制劑濃度1:60%原料及制劑濃度5:140%原料及制劑12每一措施驗證的過程由80到100次分析構成每次分析中，僅一種組分（一種色譜峰）即可產(chǎn)生7個有關成果（峰面積，保留時間，分離度等……）每一組分最終得到總共約700個數(shù)字所有這些數(shù)字需要進行數(shù)學處理：手工處理（計算器，ExcelMacro’s等）專用的措施驗證程序措施驗證的復雜性13液相色譜的措施開發(fā)14液相色譜的措施開發(fā)根據(jù)分析物的化學性質選配色譜條件基于既往經(jīng)驗及思索進行合理猜測一般輔以資料參照問詢同事“步進式”測試開發(fā)基于前一測試成果設計下一步的測試條件，逐漸進行系統(tǒng)性篩選方略先按流動相pH、有機相和固定相的直接組合進行系統(tǒng)性篩選測試評估成果，選擇最有效的條件組合再進行措施優(yōu)化梯度/溫度15影響分離度的原因選擇性最為重要MaximizedinUPLCSeparationsby:RangeofcolumnchemistriesMultipleparticlesubstratesWideusablepHrangeHighretentivityWiderangeinselectivityMaximizedinUPLCSeparationsby:Ultra-lowdispersionsystemSmall[<2μm]particlesHigherpressurecapabilityWell-designedcolumnsPhysicalChemicalImpactonResolution

DoubleNDoublekDoubleα%Improvement

20–40% 15–20% >400%16影響分離度的原因17UPLC技術加速措施開發(fā)過程可以在一種工作日內完畢措施開發(fā)!對pH、有機相和色譜柱的組合條件進行系統(tǒng)性篩查高辨別亞二微米色譜柱技術保證高辨別分離在更快的同步分離能力不打折扣可自動選擇色譜柱和流動相四元溶劑或二元混合使措施開發(fā)更以便18固定相有機溶劑流動相pH值梯度影響選擇性的重要原因19固定相20固定相Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane老式硅膠顆粒基質合成環(huán)節(jié)：1.合成硅膠基質2.鍵合配體（鍵合相）3.端基封口硅羥基21固定相鍵合相(配體)：C18殘留硅羥基端基封口基團硅膠基質合成環(huán)節(jié)：1.合成硅膠基質2.鍵合配體（鍵合相）3.端基封口22固定相FlMinutes0.001.202.403.604.80CSHC18CSHPhenyl-HexylCSHFluoro-PhenylHSSC18SBIAPFlFeDOIAPFlFeDOIAFlFeDOIAPFlFeDOPAcetonitrile,0.1%

formicacid(pH3)TestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]23固定相Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene鋁雜質含量~375ppmTfUSP=6.5

流動相pH7老式型C18硅膠柱上金屬雜質對堿性化合物峰形的影響24固定相與鍵合相的疏水性作用雙重保留機理:1).與鍵合相的的疏水性作用;2).與殘存硅醇基間的離子互換作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+當流動相pH值不不小于3時,硅醇基趨于中性(未解離)

BaseBase對堿性化合物的保留及嚴重拖尾兩試驗使用相似的老式C8硅膠柱離子互換作用當流動相為pH6-8時,硅醇基帶負電性(大部解離)堿性分析物在硅膠柱上的拖尾機理25固定相低pH也許導致分離度減少或主線不能分離！pH7.0pH2.0阿密曲替林去甲阿米替林26固定相未浸潤的孔浸潤的孔注意：保留時間與填料表面積與配體有關。然而，假如硅膠表面未濕潤，則有效的色譜表面積會減少95%，因此，減少被分析物的保留時間即等于“喪失浸潤”，記?。簬缀跛械谋砻娣e都在孔內！低有機溶劑或純水溶液流動相C18

硅膠27固定相Minutes0246810流動相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒有保留起始：填料完全浸潤－“Wetted”停止流速后：填料完全脫離浸潤狀態(tài)－“De-Wetted”喪失浸潤現(xiàn)象：

100%水溶液中保留完全喪失28流動相甲醇質子化溶劑[氫鍵供應者]洗脫能力較乙腈弱粘度較乙腈高低紫外波長下有吸取乙腈非質子化溶劑[氫鍵接受者]洗脫能力較甲醇強粘度較甲醇低低紫外波長下透光性好29流動相Jenkins,DiehlRP18LowpH(pH3)100%MeOH100%ACN1:1ACN:MeOH1243562879610121189101110,1112128,91672344315,751.Gentisicacid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroguinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dioseb(A)12.Octanophenone(N)30流動相pH值影響帶有可離子化官能團的分析物胺羧基酚有些化合物具有一種以上的可離子化官能團變化流動相pH將使選擇性發(fā)生極大變化31流動相pH值酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反相保留最大中性化合物的保留不受pH影響SilicapHRangeHybridParticlepHRangeNeueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.pH0510152025303540024681012RetentionFactor(k)酸性堿性中性化合物堿性保留增強[B]酸性保留增強[HA]32固定相、溶劑和流動相pH的影響原因IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]堿性及中性化合物33固定相、溶劑和流動相pH的影響原因IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]酸性化合物34固定相、溶劑和流動相pH的影響原因分析物在其未電離[中性]狀態(tài)時保留較強甲醇的洗脫能力較乙腈弱，因此所有化合物的保留都會得到增強，同步也具有不一樣于乙腈的選擇性當流動相pH值能變化分析物的帶電狀態(tài)時，能得到選擇性的極大變化在任一條件下，使用不一樣固定相時，能獲得大的選擇性變化最明顯的選擇性差異在于將固定相、溶劑和流動相pH原因綜合時3