出口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR法 第5部分：洋蔥伯克霍爾德氏菌

進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第5部分：洋蔥伯克霍爾德氏菌2除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：6.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.2冰箱：2℃~8℃、-20℃。6.3均質(zhì)器或乳液分散機(jī)(轉(zhuǎn)速1000rmin以上)。6.4電子天平：感量0.1g。6.5高速微量離心機(jī)(最大離心力不小于10000g)。6.6渦旋振蕩儀。6.7加熱裝置：95℃-100℃。6.9無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯。6.13離心管：2mL、1.5mL和0.2mL。6.14陽性對照：洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC25416或等效菌株或含目的片段的DNA。7.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。所有試7.2DNA提取液：見附錄A中A.1。7.3含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SLDLP)液體培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。7.5生理鹽水：見附錄A中A37.6dAPCR反應(yīng)配套試劑。7.7洋蔥伯克霍爾德氏游1號染色體特異性序列片段參見附錄B,引物探針如下：Primer-F:5'-cCNTiWCAAGACGTTCGPrimer-R:5'-CITCCGCGGATTCGACProbe-P:5'-FAM-TCGCCGTCCGCAAGATGCAGG-BH進(jìn)出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌ddPCR檢驗(yàn)程序見圖1。圖1進(jìn)出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德氏菌檢驗(yàn)程序9實(shí)驗(yàn)操作步驟9.1樣品前處理待測的樣品應(yīng)在室溫下保存，不要溫育、冷藏和冷凍樣品。樣品的制樣處理參照SN/T5075的規(guī)定執(zhí)行。9.2增菌培養(yǎng)吸取10mL1:10樣品稀釋液接種到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h~24h。混勻增菌培養(yǎng)物，在其液面表層吸取1ml.于10000g-12000g離心3min,棄去上清液。必要時(shí)，用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸沉淀，于10000g~12000g離心3min,棄去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振蕩混勻，于95℃~100℃加熱10min,室溫冷卻2min后，于10000g-12000g離心5min,取上清液作為DNA模板。若不能及時(shí)分析，DNA模板可置于-20℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?.4DNA濃度和純度測定樣品DNA使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm處的吸收值A(chǔ)一水一一6主要培養(yǎng)基和試劑滅菌一級水將Chelex-100順粒加入滅菌一級水中混勻，2℃~8℃保存。A.2含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SCDLP)液體培養(yǎng)基酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂蒸餾水先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào)pH值為7.2-7.3,分裝，每瓶90mL,121℃高壓滅菌20min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合。冷卻至25℃左右使用。使用前，用過濾除菌方法加入多粘菌素