藥品微生物檢驗技術(shù)課件 模塊二 藥品安全性檢查

《藥品微生物檢驗技術(shù)》模塊二藥品安全性檢查項目一無菌檢查

任務(wù)一氯化鈉注射液無菌檢查-直接接種法

任務(wù)二喜炎平注射液無菌檢查-薄膜過濾法

目錄項目二無菌檢查任務(wù)一氯化鈉注射液無菌檢查-直接接種法

任務(wù)引入請思考氯化鈉注射液的主要作用是補充電解質(zhì)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的水、電解質(zhì)平衡。很多藥物需要溶解在氯化鈉注射液中，才能進行肌內(nèi)注射或者靜脈注射，并直接進入血液循環(huán)。對氯化鈉注射液有什么要求呢？

現(xiàn)有一批氯化鈉注射液，需按照抽樣標準抽取一定數(shù)量并對這一批抽檢品是否無菌進行判斷。任務(wù)分析本任務(wù)以氯化鈉注射液作為研究對象，介紹氯化鈉注射液無菌檢查方法及操作，工作內(nèi)容及要求見下表。

無菌檢查法的檢查對象是《中國藥典》２０２０年版要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種。相關(guān)知識-無菌檢查法檢查對象

單向流空氣區(qū)域、工作臺面及受控環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度確認。檢查環(huán)境

無菌檢查可以確保藥品的質(zhì)量，間接反映藥品生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)條件、工藝方法和管理水平，反映藥物不同產(chǎn)地、不同批次之間的質(zhì)量差異。檢查意義本次任務(wù)所用的方法是直接接種法，即通過無菌操作技術(shù)將供試品直接接種至相應(yīng)培養(yǎng)基上，給予供試品中細菌、真菌充分的營養(yǎng)物質(zhì)與適宜的生長環(huán)境，使微生物從單個狀態(tài)培養(yǎng)成肉眼可見的菌群。相關(guān)知識-直接接種法

直接接種法硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌的培養(yǎng)；相關(guān)知識-檢查用培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基無菌檢查

3培養(yǎng)基靈敏度檢查

4方法適用性試驗5供試品接種6對照試驗7培養(yǎng)及觀察8結(jié)果判斷根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區(qū)域酒精燈

局部無菌環(huán)境75%乙醇

擦拭消毒氯化鈉注射液

供試品培養(yǎng)基

提供營養(yǎng)物質(zhì)移液器

定量移取供試品試管、試管架

容器、支架培養(yǎng)箱

微生物培養(yǎng)菌種

靈敏度檢查、陽性對照任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基的制備依據(jù)培養(yǎng)基培養(yǎng)及制備要求，按照計算用量-稱量-溶解-調(diào)pH值-分裝-滅菌完成。注意特殊物質(zhì)的溶解方式及順序，注意分裝是培養(yǎng)基裝量的高度。

計算用量

稱量

溶解

調(diào)pH值

分裝

滅菌任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基的無菌檢查制備好的培養(yǎng)基每批隨機取不少于５支（瓶），放至相應(yīng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１４天，觀察培養(yǎng)基狀態(tài)。如果培養(yǎng)基混濁，則表明培養(yǎng)基有菌，不能用；如果培養(yǎng)基澄清，則表明培養(yǎng)基無菌，符合培養(yǎng)基無菌檢查標準。任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基的靈敏度檢查菌懸液制備培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過５代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第０代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基的靈敏度檢查菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間制備方式金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種其新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上３０～３５℃培養(yǎng)１８～２４小時上述培養(yǎng)物用ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或0.9％無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液生孢梭菌接種其新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中白色念珠菌接種其新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上２０～２５℃培養(yǎng)２～３天黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上２０～２５℃培養(yǎng)５～７天或直到獲得豐富的孢子加入適量含0.05％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯80的ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液將孢子洗脫。任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基靈敏度檢查操作培養(yǎng)基名稱接種菌種試管數(shù)空白對照培養(yǎng)時間結(jié)果判斷硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（３０～３５℃培養(yǎng)）不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌每種菌種各２支１支不接種菌種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基接種細菌的培養(yǎng)基管培養(yǎng)時間不超過３天，接種真菌的培養(yǎng)基管培養(yǎng)時間不得超過５天空白對照管應(yīng)無菌生長。若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。如果加菌培養(yǎng)基管有無菌生長的現(xiàn)象，則培養(yǎng)基的靈敏度檢查不符合規(guī)定，不能使用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（２０～２５℃培養(yǎng)）不大于１００ｃｆｕ的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉每種菌種各２支１支不接種菌種的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基任務(wù)實施三、試驗操作方法適用性試驗方法適用性試驗的意義進行產(chǎn)品無菌檢查時，應(yīng)進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果，應(yīng)重新進行方法適用性試驗。方法適用性試驗對每一試驗菌應(yīng)逐一進行方法確認。任務(wù)實施三、試驗操作方法適用性試驗-操作培養(yǎng)基名稱接種菌種接種方法培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌每種菌種各２管，其中１管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另１管作為對照置于３０～３５℃培養(yǎng)箱，其中生孢梭菌需置于厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間不得超過５天胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于１００ｃｆｕ的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉置于２０～２５℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間不得超過５天結(jié)果判斷１與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查２如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑或滅活劑等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗任務(wù)實施三、試驗操作供試品的取樣檢驗數(shù)量

檢驗數(shù)量指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品及上市產(chǎn)品按《中國藥典》２０２０年版最少檢驗數(shù)量規(guī)定進行抽樣。檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品數(shù)量（ｇ、ｍＬ或ｃｍ２）。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩種培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。任務(wù)實施三、試驗操作供試品的取樣樣品的抽樣要求：

１）須采用無菌操作技術(shù)在具有無菌條件的特定區(qū)域中進行取樣，防止樣品受到微生物污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。２）應(yīng)監(jiān)測抽樣環(huán)境并記錄，同時記錄采樣時間。３）抽樣的任何消毒過程（如抽樣點的消毒）不能影響樣品中微生物的檢出。４）所抽樣品應(yīng)有清晰標識，注明樣品名稱、批號、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等信息。任務(wù)實施三、試驗操作供試品的處理與接種除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相等；生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)為２∶１。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10％，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ｍＬ，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ｍＬ。任務(wù)實施三、試驗操作供試品的處理與接種氯化鈉注射液接種操作培養(yǎng)基供試品陽性對照陰性對照培養(yǎng)條件硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氯化鈉注射液分別接種與供試品等量的金黃色葡萄球菌（不大于100cfu）至培養(yǎng)基中未接種的培養(yǎng)基３０～３５℃培養(yǎng)１４天胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基２０～２５℃培養(yǎng)１４天任務(wù)實施四、結(jié)果判斷結(jié)果觀察培養(yǎng)期間應(yīng)定期觀察，并記錄是否有菌生長。若在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液不少于１ｍＬ轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，將原始培養(yǎng)物和新接種的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不少于４天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)混蝕；或取培養(yǎng)液（物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時做菌種鑒定。陽性對照管所接種菌應(yīng)生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則試驗無效。任務(wù)實施四、結(jié)果判斷結(jié)果觀察只有符合下列至少一個條件時，方可認為試驗無效：（１）無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。（２）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（３）在陰性對照中觀察到微生物生長。（４）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。項目二無菌檢查任務(wù)二喜炎平注射液無菌檢查-薄膜過濾法

任務(wù)引入請思考喜炎平注射液是直接輸入靜脈的液體滅菌制劑，通常包裝于玻璃瓶、塑料瓶或軟袋中，使用時通過輸液器持續(xù)滴注輸入靜脈。喜炎平注射液成分中有穿心蓮內(nèi)酯磺化物，穿心蓮內(nèi)酯能清熱解毒、消炎止痛，具有一定抑菌作用?，F(xiàn)有一批喜炎平注射液，需按照抽樣標準抽取一定數(shù)量并對這一批抽檢品是否無菌進行判斷。。任務(wù)分析（１）喜炎平注射液中可能存在的微生物包括細菌、真菌。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌的培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。（２）按照培養(yǎng)基配方完成培養(yǎng)基制備，對培養(yǎng)基進行無菌檢查、靈敏度檢查，確認培養(yǎng)基適用于該試驗后，該培養(yǎng)基才能被采用。任務(wù)分析直接接種法與薄膜過濾法優(yōu)、缺點比較方法優(yōu)點缺點直接接種法供試品用量較少，比較節(jié)約不能有效除去供試品中的抑菌成分，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果薄膜過濾法操作環(huán)境相對封閉，可以有效減少外部環(huán)境的影響；能有效除去抑菌成分的影響，適用于含抑菌成分的供試品檢查消耗的供試品量較多任務(wù)分析（４）薄膜過濾法采用無菌操作技術(shù)將供試品通過集菌儀過濾后再加入相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)、觀察，需要進行方法適用性試驗，以確認該方法適用于喜炎平注射液的無菌檢查。（５）按照《中國藥典》２０２０年版規(guī)定，確定喜炎平注射液的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，在無菌室中完成供試品檢查。放置相應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，通過觀察培養(yǎng)基是混濁還是澄清來判斷供試品是否合格。

薄膜過濾法:一般采用封閉式薄膜過濾器,根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μｍ，濾膜直徑約為50ｍｍ。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。采用無菌操作技術(shù)使供試液通過集菌儀，供試品中可能存在的微生物被截留收集在濾膜上，通過沖洗液沖洗濾膜除去供試品中的抑菌成分。把所需培養(yǎng)基通過進樣管道直接注入集菌培養(yǎng)器中，放置規(guī)定的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，以檢驗供試品是否無菌。相關(guān)知識-薄膜過濾法

薄膜過濾法全封閉預(yù)滅菌不易受污染相關(guān)知識-集菌儀的使用集菌儀的操作過程：（１）取出一次性培養(yǎng)器，確認包裝完好后在無菌室內(nèi)打開無菌包裝。（２）將一次性培養(yǎng)器逐個插放在不銹鋼排液槽上。（３）將一次性培養(yǎng)器的彈性軟管裝入集菌儀的蠕動泵頭，要求定位準確，軟管走勢順暢。（４）將進樣針插入樣品中，啟動集菌儀，過濾集菌。若樣品中含有抑菌物質(zhì)，應(yīng)用適量緩沖液沖洗濾膜，方法與集菌過程相同。相關(guān)知識-集菌儀的使用（５）完成集菌后，開啟已滅菌的培養(yǎng)基，插入針頭。（６）摘下一次性培養(yǎng)器頂部空氣濾器開口的膠塞，套在一次性培養(yǎng)器的底口上，泵入相應(yīng)的培養(yǎng)基。（７）用夾子夾閉與一次性培養(yǎng)器連接部的軟管，留出５～６ｃｍ，剪除其余部分，并將開口端插在空氣濾器的開口上。（８）將培養(yǎng)器置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。相關(guān)知識-集菌儀的使用集菌儀使用注意事項（１）在集菌儀泵頭扣緊之前，嚴禁啟動開關(guān)，否則可能導(dǎo)致手部受傷。（２）若無菌室采用化學(xué)消毒劑消毒，應(yīng)將儀器移至封閉罩內(nèi)或搬出無菌室，以免損壞電子部件和儀器表面。（３）在進樣針插入瓶裝流體樣品前應(yīng)先開機，然后倒置容器瓶，以保持進樣針上的過濾膜干燥，氣流暢通，正常進液。（４）若進液管內(nèi)出現(xiàn)過多氣泡，應(yīng)將泵速降低，并檢查進氣濾膜是否被浸泡，若不能進液，則檢查進樣針是否暢通。任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基無菌檢查

3培養(yǎng)基靈敏度檢查

4方法適用性試驗5供試品集菌6對照試驗7培養(yǎng)及觀察8結(jié)果判斷根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區(qū)域酒精燈

局部無菌環(huán)境75%乙醇

擦拭消毒喜炎平注射液

供試品培養(yǎng)基

提供營養(yǎng)物質(zhì)緩沖液

沖洗濾膜集菌儀

截留樣品中的微生物培養(yǎng)箱

微生物培養(yǎng)菌種

靈敏度檢查、陽性對照任務(wù)實施三、試驗操作培養(yǎng)基的制備依據(jù)培養(yǎng)基培養(yǎng)及制備要求，按照計算用量-稱量-溶解-調(diào)pH值-分裝-滅菌完成。注意特殊物質(zhì)的溶解方式及順序，注意分裝是培養(yǎng)基裝量的高度。

計算用量

稱量

溶解

調(diào)pH值

分裝

滅菌任務(wù)實施三、試驗操作方法適用性試驗-操作培養(yǎng)基名稱接種菌種接種方法培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌按供試品的無菌檢查要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于１００ｃｆｕ的試驗菌，過濾置于３０～３５℃培養(yǎng)箱，其中生孢梭菌需置于厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間不得超過５天胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于１００ｃｆｕ的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉置于２０～２５℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間不得超過５天結(jié)果判斷１與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查２如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗任務(wù)實施三、試驗操作供試品的處理及接種喜炎平注射液為水溶性液體供試品，取規(guī)定量，直接過濾；或混合至含不少于１００ｍＬ適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于３次，以便除去抑菌成分。喜炎平注射液對革蘭陽性菌與革蘭陰性菌均有抑制作用，故選擇金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌為陽性對照菌。任務(wù)實施三、試驗操作供試品的處理及接種喜炎平注射液接種操作方法培養(yǎng)基供試品接種原則陽性對照陰性對照培養(yǎng)條件硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氯化鈉注射液沖洗后，１份濾器中加入１００ｍＬ硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，１份濾器中加入１００ｍＬ胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分別接種與供試品等量的金黃色葡萄球菌（不大于１００ｃｆｕ）至培養(yǎng)基中未接種的培養(yǎng)基３０～３５℃培養(yǎng)１４天胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基２０～２５℃培養(yǎng)１４天《藥品微生物檢驗技術(shù)》謝謝《藥品微生物檢驗技術(shù)》模塊二藥品安全性檢查項目二微生物總數(shù)檢查

任務(wù)一葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-平皿法

任務(wù)二葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-薄膜過濾法

任務(wù)三葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-最可能數(shù)法

目錄項目二微生物總數(shù)檢查任務(wù)一葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-平皿法

任務(wù)引入請思考

葡萄糖酸鈣口服溶液用于預(yù)防和治療鈣缺乏癥，如骨質(zhì)疏松、手足抽搐癥、骨發(fā)育不全、佝僂病，以及兒童、妊娠和哺乳期婦女、絕經(jīng)期婦女、老年人鈣的補充。某企業(yè)生產(chǎn)了一批葡萄糖酸鈣口服溶液，根據(jù)《中國藥典》2020年版要求需要進行微生物限度檢查。

請按照供試品取樣要求抽取一定數(shù)量的葡萄糖酸鈣口服溶液，并按照規(guī)定確定檢驗數(shù)量、檢驗量。查詢《中國藥典》2020年版四部通則1105（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法），選擇平皿法，進行微生物計數(shù)，判斷被檢藥品是否符合微生物限度規(guī)定。任務(wù)分析（１）《中國藥典》2020年版規(guī)定的微生物計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（簡稱MPN法）。本任務(wù)以葡萄糖酸鈣口服溶液為材料，選擇平皿法進行微生物計數(shù)。（２）對微生物計數(shù)需要制備適合微生物生長的培養(yǎng)基，并將微生物培養(yǎng)成肉眼可見的菌落。因此，應(yīng)按照培養(yǎng)基配方完成培養(yǎng)基制備及其適用性檢查。任務(wù)分析（３）平皿法是《中國藥典》2020年版規(guī)定的微生物計數(shù)方法之一。對于所選擇的計數(shù)方法還需要進行計數(shù)方法適用性試驗。（４）按照《中國藥典》2020年版規(guī)定，確定葡萄糖酸鈣口服溶液的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，采用無菌操作完成供試品檢查。按照規(guī)定進行菌落計數(shù)并完成檢驗報告。任務(wù)分析本任務(wù)的工作內(nèi)容及要求見下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點供試液的制備采取適宜方法制備供試液稀釋比例菌液制備選取規(guī)定菌株培養(yǎng)，制備菌液菌株選擇、培養(yǎng)及菌液制備培養(yǎng)基制備正確選擇培養(yǎng)基，完成制備計算、稱量、調(diào)節(jié)pH值、分裝、滅菌培養(yǎng)基適用性檢查接種培養(yǎng)、計數(shù)判定培養(yǎng)、結(jié)果判定培養(yǎng)基無菌檢查抽檢培養(yǎng)基放置于相應(yīng)培養(yǎng)箱中定期觀察計數(shù)方法適用性試驗試驗組、供試品對照組、菌液對照組設(shè)置方法適用性判斷供試品接種供試品抽樣、接種無菌操作陰性對照陰性對照操作對照設(shè)計培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)、觀察、記錄細菌、真菌培養(yǎng)條件結(jié)果判斷菌落計數(shù)、報告有效結(jié)果、檢品合格結(jié)果相關(guān)知識-微生物計數(shù)法1.微生物計數(shù)法的概念及要求

微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。微生物計數(shù)法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準時，應(yīng)按《中國藥典》2020年版規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，微生物計數(shù)法不適用于活菌制劑的檢查。

微生物計數(shù)試驗環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進行監(jiān)測。相關(guān)知識-微生物計數(shù)法２.計數(shù)方法

供試品檢查時，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù)方法，檢測的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。3.計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性試驗

供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查；計數(shù)方法應(yīng)進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。當(dāng)檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新進行適用性試驗。相關(guān)知識-非無菌藥品微生物限度標準

非無菌藥品的微生物限度標準是基于藥品的給藥途徑和對患者健康潛在的危害以及藥品的特殊性而制訂的，不同藥品的微生物限度標準不同。藥品生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗，藥用原料、輔料、中藥提取物及中藥飲片的檢驗，新藥標準制訂，進口藥品標準復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以此標準為依據(jù)。任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1查詢標準

2培養(yǎng)基制備

3培養(yǎng)基無菌檢查4培養(yǎng)基適用性檢查5供試液制備6菌液制備7方法適用性試驗8供試液接種9培養(yǎng)及觀察10結(jié)果判斷

根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75％乙醇擦拭消毒pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制備供試液胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)皿微生物培養(yǎng)培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)試驗菌株培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000ml實際制備___ml

制備方式用量計算各用量胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨15.0g

瓊脂15.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g

氯化鈉5.0g

水1000ml

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物胰酪胨等量合物10.0g

瓊脂15.0g

葡萄糖40.0g

水1000ml

任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備和培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)條件序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制2配制培養(yǎng)基按規(guī)定程序配制所需要的培養(yǎng)基：___________、___________滅菌后備用。3制備菌液（１）取__________、__________、__________、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。（２）取_________的新鮮培養(yǎng)物加入適量含0.05％（體積分數(shù)）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（體積分數(shù)）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備和培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)條件4接種培養(yǎng)（１）取11個無菌平皿，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各______皿，每皿接種量不大于______，最后一皿作為陰性對照。傾倒胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（被檢培養(yǎng)基）混勻凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，觀察計數(shù)（需氧菌總數(shù)）。對照培養(yǎng)基同法操作。（２）取5個無菌平皿，分別接種______、______各2皿，每皿接種量不大于______，最后一皿作為陰性對照。傾倒沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（被檢培養(yǎng)基）混勻凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，觀察計數(shù)（霉菌和酵母菌總數(shù)）。對照培養(yǎng)基同法操作5陰性對照取_______接種培養(yǎng)基后培養(yǎng)，作為陰性對照，陰性對照應(yīng)_______。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備和培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)條件6定期觀察記錄（１）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度______，培養(yǎng)時間不超過______天；（２）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度______，培養(yǎng)時間不超過______天；觀察菌落生長情況，點計平板上生長的菌落數(shù)，菌落蔓延生長成片的平板，不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)；7結(jié)果判斷_______的菌落平均數(shù)與_______的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)為_______，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；陰性對照_______，則被檢培養(yǎng)基適用性檢查符合規(guī)定。任務(wù)實施五、計數(shù)方法適用性試驗１.供試液的制備２.接種和稀釋３.抗菌活性的去除或滅活４.供試品中微生物的回收——平皿法５.結(jié)果判斷——平皿法任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制2制備培養(yǎng)基__________培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)，__________用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)3制備供試液取供試品10mL，加入_______的_______緩沖液配制成1:10的供試液。取1:10供試液_______加入含9mL_______緩沖液的試管中制成1:102的供試液，再取1:102的供試液1mL加入另一支含9mL_______緩沖液的試管中，制成1:103稀釋級的供試液4吸樣注皿分別取3個稀釋級別的供試液檢驗，每級稀釋液取1mL，置于直徑為90mm的無菌平皿中，注入15～20mL溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備_____個平皿5陰性對照吸取稀釋液（pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液）1mL，置于直徑為90mm的無菌平皿中，注入15～20mL溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容6定期觀察記錄

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度____，培養(yǎng)時間不超過____天

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度____，培養(yǎng)時間不超過____天觀察菌落生長情況，點計平板上生長的菌落數(shù)，菌落蔓延生長成片的平板，不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)7結(jié)果判斷陰性對照應(yīng)____，否則試驗無效。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定任務(wù)實施七、微生物總數(shù)檢查原始記錄表單（平皿法）任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5

能正確配制培養(yǎng)基10

能完成培養(yǎng)基滅菌操作5

2培養(yǎng)基的無菌檢查能將不同培養(yǎng)基放至相應(yīng)培養(yǎng)箱中5

能正確判斷培養(yǎng)基是否無菌5

3培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液5

能將菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中10

能正確完成培養(yǎng)基適用性檢查5

4計數(shù)方法適用性試驗?zāi)苷_設(shè)置驗證試驗5

能正確進行結(jié)果判斷5

任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分5供試品接種、培養(yǎng)、結(jié)果判斷能用無菌操作技術(shù)完成供試品接種10

能正確觀察供試品培養(yǎng)變化5

能正確判斷供試品是否合格10

6培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10

能正確完成無菌室清潔5

合計100項目二微生物總數(shù)檢查任務(wù)二葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-薄膜過濾法

任務(wù)引入請思考

任務(wù)一介紹了微生物計數(shù)方法中的平皿法，如何使用薄膜過濾法進行葡萄糖酸鈣口服溶液的微生物總數(shù)檢查呢？

請按照供試品取樣要求抽取一定數(shù)量的葡萄糖酸鈣口服溶液，并按照規(guī)定確定檢驗量，查詢《中國藥典》2020年版四部通則1105（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法），選擇薄膜過濾法，進行微生物計數(shù)，判斷被檢藥品是否符合微生物限度規(guī)定。

任務(wù)分析（１）本任務(wù)以葡萄糖酸鈣口服溶液為材料，選擇薄膜過濾法進行微生物計數(shù)。（２）薄膜過濾法是《中國藥典》2020年版規(guī)定的微生物計數(shù)方法之一。薄膜過濾法可以富集樣品中的微生物，分離去除樣品中對微生物生長產(chǎn)生干擾的因素，有效地提高檢驗結(jié)果的靈敏度和可靠性，是近年來微生物檢查領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的一種計數(shù)手段。任務(wù)分析（３）按照《中國藥典》2020年版的規(guī)定，確定葡萄糖酸鈣口服溶液的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，采用無菌操作完成供試品檢查。按照規(guī)定進行菌落計數(shù)并完成檢驗報告。

本任務(wù)的工作內(nèi)容及要求同任務(wù)一。相關(guān)知識-薄膜過濾法

薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45?，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。

水溶性供試液過濾前，先過濾少量的沖洗液以潤濕濾膜；對于油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100mL，總沖洗量一般不超過500mL，最多不得超過1000mL，以避免濾膜上的微生物受到損傷。任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1查詢標準

2培養(yǎng)基制備

3培養(yǎng)基無菌檢查4培養(yǎng)基適用性檢查5供試液制備6菌液制備7計數(shù)方法適用性試驗8供試液接種9培養(yǎng)及觀察10結(jié)果判斷

根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75％乙醇擦拭消毒ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制備供試液胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)皿微生物培養(yǎng)培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)試驗菌株培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗濾膜及薄膜過濾器富集微生物任務(wù)實施三、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000ml實際制備___ml

制備方式用量計算各用量胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨15.0g

瓊脂15.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g

氯化鈉5.0g

水1000ml

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物胰酪胨等量合物10.0g

瓊脂15.0g

葡萄糖40.0g

水1000ml

任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制2配制培養(yǎng)基按規(guī)定程序配制所需要的培養(yǎng)基：___________、___________滅菌后備用。3制備菌液（１）取__________、__________、__________、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液（２）取_________的新鮮培養(yǎng)物加入適量含0.05％（體積分數(shù)）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（體積分數(shù)）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查操作記錄4接種培養(yǎng)（１）取11個無菌平皿，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各______皿，每皿接種量不大于______，最后一皿作為陰性對照。傾倒胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（被檢培養(yǎng)基）混勻凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，觀察計數(shù)（需氧菌總數(shù)）。對照培養(yǎng)基同法操作。（２）取5個無菌平皿，分別接種______、______各2皿，每皿接種量不大于______，最后一皿作為陰性對照。傾倒沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（被檢培養(yǎng)基）混勻凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)，觀察計數(shù)（霉菌和酵母菌總數(shù)）。對照培養(yǎng)基同法操作。5陰性對照取_______接種培養(yǎng)基后培養(yǎng)，作為陰性對照，陰性對照應(yīng)_______。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查操作記錄6定期觀察記錄（１）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度______，培養(yǎng)時間不超過______天；（２）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)溫度______，培養(yǎng)時間不超過______天；觀察菌落生長情況，點計平板上生長的菌落數(shù)，菌落蔓延生長成片的平板，不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)。7結(jié)果判斷_______的菌落平均數(shù)與_______的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)為_______，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；陰性對照_______，則被檢培養(yǎng)基適用性檢查符合規(guī)定。任務(wù)實施五、計數(shù)方法適用性試驗１.供試液的制備２.接種和稀釋３.抗菌活性的去除或滅活４.供試品中微生物的回收——薄膜過濾法５.結(jié)果判斷——薄膜過濾法任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制2制備培養(yǎng)基__________培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)，__________培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)3制備供試液按平皿法制備1:10的供試液_______mL4裝膜將裝有濾膜的薄膜過濾器安裝在帶有真空裝置的支架上5潤膜薄膜過濾器中倒入pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液50mL，打開真空閥潤洗濾膜，潤洗一次6樣品過膜將適量pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液倒入薄膜過濾器，移取10mL供試液至緩沖液中，打開真空閥過濾樣品任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容7沖洗將約100mLpH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液倒入薄膜過濾器中，打開真空閥沖洗濾膜，沖洗不少于3次8貼膜用鑷子輕輕取出過濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中心9陰性對照取相應(yīng)稀釋液過濾、沖洗，作為陰性對照10培養(yǎng)將貼有濾膜的平板倒置放入培養(yǎng)箱中11結(jié)果判斷若濾膜上有菌落生長，進行菌落計數(shù)，以相當(dāng)于1g、1mL或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)任務(wù)實施七、微生物總數(shù)檢查原始記錄表單（薄膜過濾法）任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5

能正確配制培養(yǎng)基10

能完成培養(yǎng)基滅菌操作5

2培養(yǎng)基的無菌檢查能將不同培養(yǎng)基放至相應(yīng)培養(yǎng)箱中5

能正確判斷培養(yǎng)基是否無菌5

3培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液5

能將菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中10

能正確完成培養(yǎng)基適用性檢查5

4計數(shù)方法適用性試驗?zāi)苷_設(shè)置驗證試驗5

能正確進行結(jié)果判斷5

任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分5供試品接種、培養(yǎng)、結(jié)果判斷能用無菌操作技術(shù)完成供試品接種10

能正確觀察供試品培養(yǎng)變化5

能正確判斷供試品是否合格10

6培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10

能正確完成無菌室清潔5

合計100項目二微生物總數(shù)檢查任務(wù)三葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查-最可能數(shù)法

任務(wù)引入請思考

任務(wù)一與任務(wù)二分別介紹了微生物計數(shù)方法中的平皿法和薄膜過濾法，如何使用最可能數(shù)法進行葡萄糖酸鈣口服溶液的微生物總數(shù)檢查呢？

請按照供試品取樣要求抽取一定數(shù)量的葡萄糖酸鈣口服溶液，并按照規(guī)定確定檢驗量，查詢《中國藥典》2020年版四部通則1105（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法），選擇最可能數(shù)法，進行微生物計數(shù)，判斷被檢藥品是否符合微生物限度規(guī)定。任務(wù)分析（１）本任務(wù)以葡萄糖酸鈣口服溶液為材料，選擇最可能數(shù)法進行微生物計數(shù)。（２）按照《中國藥典》2020年版規(guī)定，確定葡萄糖酸鈣口服溶液的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，采用無菌操作完成供試品檢查。按照規(guī)定進行菌落計數(shù)并完成檢驗報告。

本任務(wù)的工作內(nèi)容及要求同任務(wù)一。相關(guān)知識-最可能數(shù)法

最可能數(shù)法（MPN法）用于微生物計數(shù)時精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿法，但對于某些微生物污染量很小的供試品，最可能數(shù)法可能是更適合的方法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用。最可能數(shù)法不適用于霉菌計數(shù)。任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1查詢標準

2培養(yǎng)基制備

3培養(yǎng)基無菌檢查4培養(yǎng)基適用性檢查5供試液制備6菌液制備7計數(shù)方法適用性試驗8供試液接種9培養(yǎng)及觀察10結(jié)果判斷

根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75％乙醇擦拭消毒ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制備供試液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)試驗菌株培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗補充1補充2任務(wù)實施三、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000ml實際制備___ml

制備方式用量計算各用量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g

葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g

大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g

氯化鈉5.0g

磷酸氫二鉀2.5g

水1000ml任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制。2配制培養(yǎng)基按規(guī)定程序配制所需要的培養(yǎng)基：___________。滅菌后備用。3制備菌液取__________、__________、__________用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。4接種培養(yǎng)取_____支無菌試管，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌各_____管，每管接種不大于_____的菌液，最后一管作為陰性對照。按規(guī)定條件培養(yǎng)，觀察計數(shù)（需氧菌總數(shù)）。對照培養(yǎng)管同法操作。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查操作記錄5陰性對照取_______接種培養(yǎng)基后培養(yǎng)，作為陰性對照，陰性對照應(yīng)_______。6定期觀察記錄（１）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管，培養(yǎng)溫度___，培養(yǎng)時間不超過____天（２）觀察菌落生長情況7結(jié)果判斷陰性對照_____；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)_____。任務(wù)實施五、計數(shù)方法適用性試驗１.供試液的制備２.接種和稀釋３.抗菌活性的去除或滅活４.供試品中微生物的回收——最可能數(shù)法５.結(jié)果判斷——最可能數(shù)法任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容1配制稀釋液pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的配制2制備培養(yǎng)基按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中_____的測定__________培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)3制備供試液制備1:10的供試液_______mL4稀釋用進行______10倍系列稀釋，至少3個連續(xù)稀釋級5接種每一稀釋級取3份

____

mL分別接種至3管裝有_____

mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的試管中任務(wù)實施六、供試品檢查供試品檢查操作記錄序號步驟操作內(nèi)容6陰性對照取

______接種培養(yǎng)基后培養(yǎng)，作為陰性對照7培養(yǎng)接種管置______℃培養(yǎng)______天，逐日觀察各管微生物的生長情況8結(jié)果判斷根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表2-2-23中查供試品1g、1mL或10cm2中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)任務(wù)實施七、微生物總數(shù)檢查原始記錄表單（薄膜過濾法）任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5

能正確配制培養(yǎng)基10

能完成培養(yǎng)基滅菌操作5

2培養(yǎng)基的無菌檢查能將不同培養(yǎng)基放至相應(yīng)培養(yǎng)箱中5

能正確判斷培養(yǎng)基是否無菌5

3培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液5

能將菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中10

能正確完成培養(yǎng)基適用性檢查5

4計數(shù)方法適用性試驗?zāi)苷_設(shè)置驗證試驗5

能正確進行結(jié)果判斷5

任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分5供試品接種、培養(yǎng)、結(jié)果判斷能用無菌操作技術(shù)完成供試品接種10

能正確觀察供試品培養(yǎng)變化5

能正確判斷供試品是否合格10

6培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10

能正確完成無菌室清潔5

合計100《藥品微生物檢驗技術(shù)》謝謝《藥品微生物檢驗技術(shù)》模塊二藥品安全性檢查項目三控制菌檢查

任務(wù)一銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查

任務(wù)二藿香正氣水中金黃色葡萄球菌的檢查

任務(wù)三五靈脂中沙門菌的檢查

任務(wù)四沙丁胺醇吸入氣霧劑中銅綠假單胞菌的檢查

任務(wù)五硝酸益康唑栓中白色念珠菌的檢查

任務(wù)六婦必舒陰道泡騰片中梭菌的檢查

目錄項目三控制菌檢查任務(wù)一銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查

任務(wù)引入請思考銀杏葉片具有活血、化瘀、通絡(luò)等作用，主要用于治療心血管類疾病，有降壓、降低膽固醇等功效，且對動脈硬化引起的癡呆等有一定的療效，是老年人常用藥物。這類非無菌藥品在控制菌檢查方面有什么特殊要求呢？

任務(wù)分析（１）對大腸埃希菌的檢查為定性檢查，因此需要借助鑒定培養(yǎng)基進行菌種鑒定。（２）按照培養(yǎng)基配方完成培養(yǎng)基制備，并進行適用性檢查，在確保培養(yǎng)基適用于該試驗后，該培養(yǎng)基才能被采用。（３）控制菌檢查需要做方法適用性試驗，以確定該方法是適用于該試驗的。（４）按照《中國藥典》2020年版的規(guī)定，確定銀杏葉片的檢驗數(shù)量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，在無菌室中完成供試品控制菌檢查，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長，并對其進行品種鑒定。任務(wù)分析工作內(nèi)容及要求見下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點培養(yǎng)基制備正確選擇培養(yǎng)基，完成制備計算、稱量、調(diào)節(jié)pH值、分裝、滅菌培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備、菌液接種、培養(yǎng)觀察培養(yǎng)基適用性判斷方法適用性試驗供試組、對照組設(shè)置方法適用性判斷供試品接種供試品抽樣、接種正確抽樣、試管口無菌操作、培養(yǎng)皿無菌操作、無菌環(huán)境維持對照實驗陽性對照、陰性對照操作對照設(shè)計培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)、觀察、記錄大腸埃希菌培養(yǎng)條件、鑒定現(xiàn)象結(jié)果判斷結(jié)果判斷有效結(jié)果、檢品合格結(jié)果相關(guān)知識

控制菌檢查法的檢查對象為非無菌產(chǎn)品，用于檢查供試品中是否存在特定的微生物。《中國藥典》2020年版制劑通則要求以動物、植物、礦物來源的非單體成分制成的片劑，生物制品片劑，以及黏膜或皮膚炎癥或腔道等局部用片劑（如口腔貼片、外用可溶片、陰道片、陰道泡騰片等），按照通則1106（非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法）檢查，應(yīng)符合規(guī)定?？刂凭鷻z查法的檢查對象相關(guān)知識（１）非無菌藥品需要根據(jù)其用藥途徑、目標人群的用藥特點等進行一項或多項控制菌的檢查，以此為患者的用藥安全負責(zé)。（２）非無菌藥品中可能的微生物污染來自制水系統(tǒng)、原料、輔料、設(shè)備、人員和環(huán)境等，生產(chǎn)的過程控制和生產(chǎn)加工工藝直接影響最終的微生物污染水平，如果在檢驗過程中發(fā)現(xiàn)了控制菌，則表示在某環(huán)節(jié)出現(xiàn)了污染、控制措施處于失控狀態(tài)或生產(chǎn)工藝異常，提示企業(yè)應(yīng)根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果進行偏差調(diào)查并采取必要措施?？刂凭鷻z查的意義相關(guān)知識大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬細菌，是人和動物體內(nèi)的常住菌，在腸道中可合成維生素B和維生素K。但有些菌株可感染人和動物，引起腹瀉、化膿和敗血癥。大腸埃希菌隨糞便排出體外，污染環(huán)境。藥品受到糞便污染，有可能帶有腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體。藥品中檢出大腸埃希菌表明該藥品已受到糞便污染，服用后有可能被病原體感染。大腸埃希菌任務(wù)實施一、制訂工作計劃序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1培養(yǎng)基制備2培養(yǎng)基適用性檢查3方法適用性試驗4供試品接種5對照試驗6培養(yǎng)及鑒定7結(jié)果判斷根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無菌室操作場所超凈工作臺操作區(qū)域酒精燈局部無菌環(huán)境75%乙醇擦拭消毒銀杏葉片供試品胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、MUG(4-甲基傘形酮葡糖苷酸)營養(yǎng)培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，進行大腸埃希菌的鑒定任務(wù)實施二、試驗前準備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途移液器定量移取供試液試管、試管架容器、支架培養(yǎng)皿容器培養(yǎng)箱細菌培養(yǎng)菌種培養(yǎng)基適用性檢查、檢查方法適用性試驗、陽性對照補充1：補充2：任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備按照胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基配方，計算實際所需培養(yǎng)基用量，根據(jù)培養(yǎng)基制備方式完成培養(yǎng)基制備。任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨17.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g葡萄糖/無水葡萄糖2.5/2.3g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g水1000mL麥康凱液體培養(yǎng)基明膠胰酶水解物20.0g除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ｐＨ值使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分裝，滅菌乳糖10.0g牛膽鹽5.0g溴甲酚紫10.0mg水1000mL任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量麥康凱瓊脂培養(yǎng)基明膠胰酶水解物17.0g除乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2，加入乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂，加熱煮沸1min，并不斷振搖，分裝，滅菌胨3.0g乳糖10.0g脫氧膽酸鈉1.5g氯化鈉5.0g中性紅30.0mg結(jié)晶紫1.0mg瓊脂13.5g水1000mL曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100.0ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱熔化后，冷卻至６０℃，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿20%乳糖溶液5.0ml曙紅鈉指示液2.0ml亞甲藍指示液1.3～1.6ml任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量蛋白胨5.0g取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后的pH值為6.6~7.0，分裝于小試管中,121℃滅菌15minMUG培養(yǎng)基牛肉浸膏3.0gMUG0.1G水1000mL磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基蛋白胨7.0g取上述成分混合，微溫使溶解，調(diào)pH值使滅菌后的pH值為7.3±0.1，分裝于小試管中,121℃滅菌15min葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀3.8g水1000mL任務(wù)實施三、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基名稱配方制備1000mL實際用量___mL制備方式用量計算用量枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉5.0g除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)pH值使滅菌后的pH值為6.9±0.1，加入瓊脂,加熱溶脹，然后加入指示液，混勻，分裝于小試管中,121℃滅菌15min，制成斜面硫酸鎂0.2g磷酸二氫銨1.0g磷酸氫二鉀1.0g枸櫞酸鈉(無水)2.0g瓊脂14.0g1.0%溴麝香草酚藍指示液10.0mL水1000mL任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查供試品控制菌檢查中所使用的商品化預(yù)制培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查，檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性。任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查本任務(wù)是檢查藥品中是否存在大腸埃希菌，檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑菌能力和指示特性見下表?？刂凭鷻z查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌任務(wù)實施四、培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查具體操作見表。培養(yǎng)基名稱試驗菌培養(yǎng)條件結(jié)果胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h與對照培養(yǎng)基比較

，被檢培養(yǎng)基試驗菌應(yīng)生長良好麥康凱液體培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌42~44℃培養(yǎng)不超過24h與對照培養(yǎng)基比較

，被檢培養(yǎng)基試驗菌應(yīng)生長良好不少于100cfu的金黃色葡萄球菌42~44℃培養(yǎng)不少于48h試驗菌應(yīng)不得生長麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過18h被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過24h被檢培養(yǎng)基中試驗菌的試驗現(xiàn)象應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過48h被檢培養(yǎng)基中試驗菌的試驗現(xiàn)象應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致枸櫞酸鹽培養(yǎng)基不大于100cfu的大腸埃希菌30~35℃培養(yǎng)不超過48h被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小

、形態(tài)特征

、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致任務(wù)實施五、控制菌檢查方法適用性試驗為確保使用的檢查方法有效，在進行控制菌檢查時需對所用的檢查方法進行適用性試驗。取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。供試液制備方式同微生物計數(shù)法。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。本任務(wù)中方法適用性試驗所用試驗菌為大腸埃希菌，具體操作見下表。任務(wù)實施五、控制菌檢查方法適用性試驗培養(yǎng)基名稱接種方法培養(yǎng)條件胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1管作為對照30~35℃培養(yǎng)18h麥康凱液體培養(yǎng)基42~44℃培養(yǎng)24h麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩個平板，其中1個平板接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1平板作為對照30~35℃培養(yǎng)18h曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基30~35℃培養(yǎng)18hMUG營養(yǎng)培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1管作為對照30~35℃培養(yǎng)24h磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48h枸櫞酸鹽培養(yǎng)基接種不大于100cfu的大腸埃希菌兩個斜面，其中1個斜面接入每支培養(yǎng)基規(guī)定接種量的供試液，另1斜面作為對照37℃培養(yǎng)48h任務(wù)實施五、控制菌檢查方法適用性試驗上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抑制作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。任務(wù)實施六、供試品檢查大腸埃希菌的檢查流程如下。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-形態(tài)鑒定在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈桃紅、微紅或中心桃紅，扁平，圓形，光滑濕潤，如下圖所示。由于藥物的影響，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落色澤、質(zhì)地、形態(tài)可能有改變，應(yīng)挑取多個菌落進行鑒定，切勿遺漏。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-形態(tài)鑒定大腸埃希菌菌落在曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基上呈紫黑色、淺紫色或藍紫色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤，如圖所示。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（1）MUG-Indole試驗。取已培養(yǎng)18～24h的麥康凱液體培養(yǎng)液（供試品管、陽性對照管、陰性對照管）各0.2ml，分別接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)。30~35℃培養(yǎng)5h和24h后在366nm紫外光下各觀察一次，同時取未接種的MUG營養(yǎng)培養(yǎng)基管作為本底對照。若紫外光下管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；若不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。沿管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)（Indole）試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；若液面呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照管和陰性對照管應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。陽性對照管應(yīng)為MUG陽性和靛基質(zhì)陽性；否則，試驗無效。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（2）甲基紅（MR）試驗。取可疑菌落接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)2～5天，取1mL培養(yǎng)物加入數(shù)滴甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)培養(yǎng)物呈鮮紅色或橘紅色，陰性反應(yīng)培養(yǎng)物呈黃色。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（3）乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P試驗）。取可疑菌落接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)48h±2h，取2mL培養(yǎng)物加入1mL６%α－萘酚乙醇溶液，混勻，再加入0.4mL40%的NaOH溶液，充分振搖后觀察結(jié)果。培養(yǎng)物在加入試劑后立刻或數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽性反應(yīng)，無紅色為陰性反應(yīng)。若為陰性反應(yīng)，置37℃水浴4h后再觀察。任務(wù)實施七、大腸埃希菌的鑒定-生化鑒定（4）枸櫞酸鹽（Ｃ）利用試驗。取可疑菌落接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h±2h，觀察結(jié)果。斜面有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色為陽性反應(yīng)；斜面無菌生長，培養(yǎng)基仍是綠色為陰性反應(yīng)。任務(wù)實施八、銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容1取樣及樣品處理按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的檢驗數(shù)量進行抽樣，一般應(yīng)隨機抽取不少于

個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為

。取供試品，用

溶解或稀釋制成1:10供試液。2增菌培養(yǎng)取10mL供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，

℃培養(yǎng)

h。3分離與純培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物

mL接種至100mL

培養(yǎng)基中，

℃培養(yǎng)

h。取

培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72h。4形態(tài)檢查與鑒別培養(yǎng)及制備在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈

，扁平，圓形，光滑濕潤；在曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基平板上，大腸埃希菌菌落呈

，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有

。任務(wù)實施八、銀杏葉片中大腸埃希菌的檢查步驟序號步驟操作內(nèi)容5生化鑒定MUG-Indole試驗：取已培養(yǎng)18~24h的麥康凱液體培養(yǎng)物

mL,接種至

mLMUG營養(yǎng)培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)

h和

h后在366nm紫外光下各觀察一次。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG

;若不呈現(xiàn)熒光，為MUG

。然后沿管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)

；若呈試劑本色，為靛基質(zhì)

。甲基紅(MR)試驗：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)2~5天，取1mL培養(yǎng)物加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)培養(yǎng)物呈鮮紅色或橘紅色，陰性反應(yīng)培養(yǎng)物呈

。乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P試驗）：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)48h±2h,取2mL培養(yǎng)物加入1mL6%α-萘酚乙醇溶液，混勻，再加入0.4mL40%的NaOH溶液后觀察結(jié)果。培養(yǎng)物在加入試劑后的4h內(nèi)呈

為陽性反應(yīng)，無

為陰性反應(yīng)。枸櫞酸鹽(C)利用試驗：取可疑菌落接種于

培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h±2h,觀察結(jié)果。斜面有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)?/p>

為陽性反應(yīng)；斜面無菌生長，培養(yǎng)基仍是綠色為陰性反應(yīng)。任務(wù)測評序號考核內(nèi)容考核標準配分得分1培養(yǎng)基制備能正確計算培養(yǎng)基各組分用量5能正確配制培養(yǎng)基10能完成培養(yǎng)基滅菌操作52培養(yǎng)基適用性檢查能制備各菌種的菌液10能將菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中10能正確判斷培養(yǎng)基適用性53控制菌檢查方法適用性試驗?zāi)芡瓿煽刂凭鷻z查方法適用性試驗5能判斷該方法是否可行并改進54控制菌檢查能用無菌操作技術(shù)完成供試品中控制菌檢查各項操作10能正確觀察供試品各類現(xiàn)象并判斷結(jié)果10能正確判斷供試品是否檢出控制菌105培養(yǎng)物處理、無菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理10能正確完成無菌室清潔5合計100項目三控制菌檢查任務(wù)二藿香正氣水中金黃色葡萄球菌的檢查

任務(wù)引入請思考葡萄球菌屬細菌是一群革蘭氏陽性球菌，在顯微鏡下，它們?yōu)榍蛐危ㄇ蚓?，堆積排列呈葡萄串狀，故名葡萄球菌。葡萄球菌感染可引起各種化膿性炎癥，可波及全身引起敗血癥、膿毒血癥等；還有由外毒素引起的中毒性疾病，如食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征、毒性休克綜合征等?？股貥藴势返男r單位是明確標明的。配制標準品溶液時稱量的標準品數(shù)量無法預(yù)先確定，如何根據(jù)標準品的稱量數(shù)量計算出緩沖液的用量，配制出準確濃度的抗生素標準品溶液？那么怎樣進行藥品的金黃色葡萄球菌的檢查呢？任務(wù)分析通過對藿香正氣水中金黃色葡萄球菌檢查，學(xué)習(xí)一下怎樣進行金黃色葡萄球菌檢查，工作內(nèi)容及要求見下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點培養(yǎng)基制備選擇正確培養(yǎng)基、完成制備計算、稱量、調(diào)節(jié)PH、分裝、滅菌培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)抽檢培養(yǎng)基放置相應(yīng)培養(yǎng)箱觀察是否有菌生長培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備、菌液接種、培養(yǎng)觀察微量移液器使用、適用性判斷方法適用性試驗供試組、對照組設(shè)置方法適用性判斷供試品接種供試品抽樣、接種正確抽樣、無菌操作無菌環(huán)境維持對照實驗陽性對照、陰性對照操作對照設(shè)計培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)、觀察、記錄培養(yǎng)條件結(jié)果判斷結(jié)果判斷有效結(jié)果、檢品合格結(jié)果相關(guān)知識

控制菌檢查法是利用相應(yīng)培養(yǎng)基在適宜條件下給相應(yīng)菌種提供所需營養(yǎng)，使其良好生長。金黃色葡萄球菌檢查采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)，再取增菌液在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。一、控制菌檢查法相關(guān)知識

二、操作重難點環(huán)節(jié)操作環(huán)節(jié)描述培養(yǎng)基的制備根據(jù)所需培養(yǎng)基用量計算培養(yǎng)基各組分用量、培養(yǎng)基121℃高壓蒸汽滅菌15~20分鐘無菌環(huán)境的創(chuàng)造與維持操作前后對超凈工作臺進行酒精擦拭滅菌、穿好防護服、避免染菌操作、定期清潔無菌室移液器的無菌操作取液時槍頭內(nèi)不出現(xiàn)氣泡、勤于更換槍頭培養(yǎng)過程觀察培養(yǎng)基任務(wù)實施一、制訂工作計劃根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進度計劃，并根據(jù)小組成員的特點進行分工。序號工作內(nèi)容完成時間成員負責(zé)人1培養(yǎng)基制備

2培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)

3培養(yǎng)基適用性檢查

4方法適用性試驗