SBP增效型快速反應(yīng)性疫苗的開發(fā)與應(yīng)急防護(hù)研究

SBP增效型快速反應(yīng)性疫苗的開發(fā)與應(yīng)急防護(hù)研究朱乃碩教授、博導(dǎo)微生物與免疫學(xué)研究室復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院

2017年7月2日

一、開發(fā)高效疫苗增效劑的必要性

1、病毒嚴(yán)重危害著人類健康突發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件及傳染病難題：無特效抗病毒藥，現(xiàn)有疫苗見效慢2、佐劑應(yīng)用現(xiàn)狀：

國內(nèi)被批準(zhǔn)的佐劑專利123項(xiàng)國外的佐劑專利2000余項(xiàng)現(xiàn)有WHO批準(zhǔn)人用疫苗佐劑僅有四種：

鋁佐劑、鈣佐劑、MF59和病毒體（Virosome）

存在問題：較弱。難以同時達(dá)到高效、低毒、快速、廣譜的疫苗增效目的。3、當(dāng)前疫苗研究中的問題反應(yīng)速度慢，效率低的問題：ＨＢＶ疫苗３針、６個月、10%無效！至今有許多疫苗尚未研發(fā)成功：HIV、HCV、RSV……針對變異病原體疫苗的同源保護(hù)問題：如流感病毒……

3、高效、安全、廣譜的快速免疫增效劑

仍屬空白

高效快速——

防治兼效型疫苗（潛伏期或在病

程中產(chǎn)生免疫保護(hù)），應(yīng)急預(yù)治。

廣譜——可普適于多種疫苗，減少新病原體

疫苗開發(fā)周期

安全無毒——可用于人體

我室發(fā)現(xiàn)的SBP分子作為免疫佐劑，即具有高效、快速、廣譜、無毒的優(yōu)點(diǎn)

二、前期研究工作1、SBP基本信息

發(fā)現(xiàn):人肝噬菌體展示庫用HBsAg免疫親和篩查中發(fā)現(xiàn)。性質(zhì)：344aa，MW≈38kD,可溶；pI≈8.0

存在：正常人血清（微量）

我室基因工程表達(dá)了SBP蛋白，制備了單克隆

抗體，免疫調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)SBP有如下功能：

2、實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)的SBP功能

與HBsAg有親和性

增強(qiáng)DC對外源抗原的吞噬

提高小鼠血清對乙肝疫苗的抗體滴度

與BSA交聯(lián)提高小鼠血清對BSA抗體滴度

SBP對Balb/c小鼠抗乙肝疫苗抗體效價的影響

對小鼠不同部位同時注射乙肝疫苗和SBP，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組血清抗體效價明顯高于單純注射乙肝疫苗對照組近5倍SBP對HBsAg免疫的時間效價關(guān)系圖由圖可見，SBP乙肝疫苗聯(lián)用組，其抗體效價在短時間內(nèi)以更快速率上升，在同樣的20天時間內(nèi)實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的抗原特異向抗體為對照組的將近5倍，加強(qiáng)免疫之后達(dá)到相同效價所需時間大大低于對照組增效普適性研究：

SBP對BSA抗原的免疫增效性

2ugBSA+SBP增效達(dá)80倍；在10ug劑量增效達(dá)100倍以上

免疫10天后小鼠血清劑量效價關(guān)系圖

高效疫苗增效分子SBP的發(fā)現(xiàn):

用HBsAg免疫親和篩查人cDNA噬菌體展示庫中發(fā)現(xiàn)乙肝表面抗原結(jié)合蛋白（SBP）可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫增效作用，具有快速、高效、低毒的特點(diǎn)。性質(zhì)：344aa，MW≈38kD,可溶;pI≈8.0

存在：正常人血清（微量）：

課題完成情況與成果完成了SBP增效型乙肝疫苗的臨床前研究：完成了SBP基因工程菌種鑒定（在中檢院完成）完成了SBP的生產(chǎn)工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和制定（GM公司）完成了SBP增效型乙肝疫苗的三批生產(chǎn)（在大連漢信公司）完成了SBP生物安全評價實(shí)驗(yàn)（在上海安評中心、北京昭衍安評公司）完成了SBP的藥理、藥效及增效機(jī)制研究(小鼠、大鼠、食蟹猴)完成了對SBP免疫增效機(jī)理的研究有新的發(fā)現(xiàn)待籌集好經(jīng)費(fèi)即可申報臨床試驗(yàn)批文（申報費(fèi)用提高，原預(yù)算不足，需另籌）已取得成果：1)申請專利5項(xiàng)，授權(quán)4項(xiàng)（3項(xiàng)國際專利：美國、日本各1項(xiàng)）2)已發(fā)表論文10篇；3）培養(yǎng)博士和博士后4名，碩士3名。

完成情況及主要成果

1、完成了SBP的藥效學(xué)研究(小鼠、大鼠、食蟹猴)

動物分為6組，每組10只，分別為疫苗對照組，空白對照組，以及不同劑量SBP組。SBP與乙肝表面抗原不同組合肌肉注射。免疫動物后，用ELISA法檢測各組動物的抗體效價并統(tǒng)計分析結(jié)果：SBP增效型乙肝疫苗能在接種21d顯著提高乙肝疫苗對Balb/c小鼠和食蟹猴的免疫抗體滴度（達(dá)到5倍以上），說明SBP是很強(qiáng)的乙肝疫苗增效作用?？赡軐?shí)現(xiàn)臨床免疫程序由3針變?yōu)?針！小鼠的抗體效價大鼠的抗體效價食蟹猴的抗體效價2、SBP的藥理與增效機(jī)制研究（1）a.SBP促進(jìn)DC成熟b.SBP有效地促進(jìn)DC對抗原吞噬SBP能有效促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞對抗原的吞噬、加工遞呈，刺激T細(xì)胞增殖c.SBP促進(jìn)DC對抗原的加工遞呈并高效地刺激CD4+T細(xì)胞增殖達(dá)3倍在SBP的作用下，HBsAg預(yù)刺激后的BMDC對CD4+T細(xì)胞增殖作用提高了3倍。

DC細(xì)胞孵育5天后分為4組，分別加入疫苗，PBS，SBP、以及SBP+HBV抗原。用流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量并統(tǒng)計分析

SBP體內(nèi)作用機(jī)理研究（2）SBPSBPSBP通過激活NF-κB及MAPK信號通路活化BMDC發(fā)現(xiàn)SBP受體為：CD64、CD32和FcRn，均可與SBP結(jié)合發(fā)現(xiàn)SBP可抑制HBsAg誘發(fā)的Treg細(xì)胞亞群分化，打破免疫耐受；發(fā)現(xiàn)SBP可促進(jìn)B細(xì)胞活化

3、SBP的藥代和生物安全評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(由國家上海新藥安全評價研究中心完成)

SBP對小鼠的最大耐受量>80mg/kg，高于有效劑量的320倍無任何毒性反應(yīng)。

結(jié)論：SBP能夠在較短時間內(nèi)（30天左右）提高現(xiàn)有乙肝疫苗所誘生的抗體滴度，并且無明顯的毒性反應(yīng)。

研究成果

4、完成了SBP三批臨床試驗(yàn)產(chǎn)品的生產(chǎn)

菌株SBP基因測序結(jié)果工程菌株SBP基因序列和蛋白表達(dá)穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量合格中試生產(chǎn)工藝SBP蛋白表達(dá)研究三批臨床試驗(yàn)產(chǎn)品（3000支）

中檢院菌種鑒定報告5、論文、專利與成果1）申請專利5項(xiàng)，獲得國際專利授權(quán)2項(xiàng)，中國專利授權(quán)1項(xiàng)：

美國專利1項(xiàng)，專利號：

US8895237B2

日本專利1項(xiàng)，專利申請?zhí)枺篘o.558624美國專利日本專利序號授權(quán)的專利名稱專利號國別1AproteinasanadjuvantthatcanbeusedtoenhancetheimmunogenicityofHepatitisBvaccineanditsgeneUS8895237B2USA2AnenhancingofhepatitisBvirusvaccineanditsgeneNo.2008-558624日本33′-脫氧腺苷在制備廣譜疫苗增效的免疫佐劑中的應(yīng)用2014100393759中國4一種具有免疫負(fù)調(diào)控作用的基因工程蛋白及其制備方法與應(yīng)用201410107482.0中國5一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應(yīng)用2013100119108.0中國中國專利已發(fā)表論文10篇：ChongwenZhang,LiGong,NaishuoZhu?.Ahuman-derivedproteinSBP(HBsAg-bindingprotein)canbindtohepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)andenhancetheimmuneresponsetohepatitisBvirus(HBV)vaccine.[J]Molecularimmunology,2013;53(1-2):60-71.2.XiaoboHu,RuiLiu,NaishuoZhu?.EnhancementofhumoralandcellularimmuneresponsesbymonophosphoryllipidA(MPLA)asanadjuvanttotherabiesvaccineinBALB/cmice.[J]Immunobiology.2013,281:1524-1528.

3.JiezuanYang,JiajiaChen,JianqinHe,YiruiXie,YixingZhu,HongcuiCaoandLanjuanLi.ProfilingtherepertoireofT-cellreceptorbeta-chainvariablegenesinperipheralbloodlymphocytesfromsubjectswhohaverecoveredfromacutehepatitisBvirusinfection.Cellular&MolecularImmunology(2014)11,332–3424..李津，范長勝，朱乃碩.表達(dá)乙肝表面抗原結(jié)合蛋白的畢赤酵母工程菌遺傳穩(wěn)定性研究.藥物生物技術(shù)，2014，21（1）：18-215.常曉月，朱嗣博，朱乃碩等.乙型肝炎病毒疫苗免疫不應(yīng)答群體中蛋白質(zhì)組表達(dá)差異性的初步研究.微生物與感染，2014，9（3）：139-1466.蕫越，楊艷，朱乃碩.畢赤酵母工程菌表達(dá)乙肝表面抗原（SBP）的發(fā)酵純化工藝研究，中國生物工程雜志2014，34（12）：59-687.高學(xué)鵬，朱嗣博，趙瑞華等.基于ChIP-Seq進(jìn)行腫瘤/睪丸抗原XAGE-1b的DNA結(jié)合位點(diǎn)鑒定.[J]中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014,30(7):611-618.8.胡曉波，朱乃碩.狂犬病毒MHC限制性CTL于Th表位的預(yù)測與鑒定.中國免疫學(xué)雜志.[J]2013,29(7):736-740.9.白荷露,劉蕊,朱乃碩.乙肝病毒X基因可調(diào)控表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建.生物技術(shù)通報，2013，2：140-14510.孫勇，湯必奎，朱乃碩等.慢病毒介導(dǎo)的HBV-X基因可調(diào)控表達(dá)小鼠模型的構(gòu)建.復(fù)旦學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，52(4)：447-4595、論文、專利與成果標(biāo)志性成果及后續(xù)轉(zhuǎn)化工作：

1、正在進(jìn)行SBP增效型乙肝疫苗對慢性感染動物(HBV-Tg小鼠)抗病毒治療研究,可能為乙肝治療型疫苗開發(fā)打下基礎(chǔ)。

2、SBP增效型乙肝疫苗可能實(shí)現(xiàn)臨床免疫程序由3針變?yōu)?針！

3、新型免疫增效分子SBP研究中有重要突破性發(fā)現(xiàn)：

（1）SBP對病毒抗原免疫增效具有廣譜性

（2）對狂犬病疫苗具有極強(qiáng)的高效快速反應(yīng)性免疫增效作用。

（3）具有3項(xiàng)國際自主知識產(chǎn)權(quán)專利

SBP顯著提高小鼠狂犬疫