T-CVMA 206-2024 貓呼吸道癥候群五種病原熒光RAA檢測方法

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I1貓呼吸道癥候群五種病原熒光RAA檢測方法本文件描述了貓呼吸道癥候群五種病原熒光RAA本文件適用于貓呼吸道癥候群（貓杯狀病毒、貓皰疹病毒Ⅰ型、貓支原體、貓衣原體、支氣管敗血NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范4縮略語DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆轉錄病毒（moloneymurineRNA：核糖核酸（ribonucleicaRAA：重組酶介導鏈替換核酸擴增（recombinase-aidamplificaRT-RAA：反轉錄重組酶介導鏈替換擴增（2）：Na2EDTA。）：），）：3樣品的采集、保存與運輸按照NY/T5用無菌拭子輕輕擦拭眼分泌物后，置于1mL的PBS緩沖液樣品保存管，4℃保存?zhèn)溆谩⒑锌谇唬ū牵┦米踊蜓鄯置谖锸米訕悠繁４婀茉谛郎u震蕩儀上充分混勻，8.1.1在樣本制備區(qū)進行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核440個循環(huán)，在第二階段循環(huán)結束收集熒9結果判斷與表述9.1質量控制）；＜20min，則重復一次。如再次檢測結果仍然是15min＜T值（時間20min，則判定被檢樣品陽性，如無報告T值（時間）或無熒光對數(shù)增長則判定被檢樣品陰性，表述5A.1貓杯狀病毒陽性對照制備合成貓杯狀病毒裝甲RNA假病毒（MS2噬菌體假病毒），將裝甲RNA假病毒載體轉化至大腸桿菌BL21（DE3）表達系統(tǒng)后誘導表達純化獲得裝甲RNA病毒顆粒，并對提取后裝甲RNA病毒顆粒進行逆轉錄和貓杯狀病毒的熒光PCR檢測。檢測將陽性對照母液10倍系列稀釋之后，選取104拷貝/μL稀A.2貓皰疹病毒、貓支原體、貓衣原體、支氣管敗血波氏桿菌陽性對照制備載體，再轉化至DH5α感受態(tài)細胞，構建重組質粒，提取重組質粒進行PCR檢測和測序分析，結果正確支氣管敗血波氏桿菌實時RAA熒光檢測的陽性對照母液。將陽性對照母液10倍系列稀釋之后，選取1046貓杯狀病毒熒光RT-RAA引物探針序列引物/探針序列（5'→3'）TTTGGAGCATTACAACAGCCAGTORF1AGTATTTAAGCACGTTAGCGCAGGTATTTGAGTGGCATGACCGCCCTACACTGTGA[FAM-d引物/探針序列（5'→3'）UL23TCTTGCTTGATAGTGGGCGGGTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGG[引物/探針序列（5'→3'）TGCAGGAGATAACGCTGGATTATTAtufMYC.F-RAATTCTGTGTGAGGGATAATTGAACTGGATTATTACTTCGTGGAGTAAACCGTGAAGA[引物/探針序列（5'→3'）GCTATACGGGTTCGATCATCTTTpmp9TAGATGGGCTCCTTTTTCTA7引物/探針序列（5'→3'）ATGAAGCATGTTTCTAAATTTTCCCAACC[FAM-dT]引物/探針序列（5'→3'）ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCGGTTTCCAATTTGAAGAAA8C.1貓杯狀病毒陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.PP554943.1）TTTGGAGCATTACAACAGCCAGTTTAATGGCGTGGAGGCGCGGTATGACCAGATGAGTGGCATGACCGCCCTACACTGTGATGTGTTCGAAGTTTGAGCATGTGCTCAACCTGACGTGCTTAAATACTC.2貓皰疹病毒陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.PQ323570.1）GTACCTGGTCAGAGCGGATGAAAATCGACCGGGATATACTTACTACTTCCGCTATACTGGCGTAGTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGTGGTGAATTATCAGCTGAAGATGCTGCCTATATCACCGCCCACTATCAAGCAAGAC.3貓支原體陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.FJ896388.1）TGCAGGAGATAACGCTGGATTATTACTTCGTGGAGTAAACCGTGAAGATATTGACAAGTTTTAGCTAAACCAGGTTCAATTATCCCTCACACAGAATTC.4貓衣原體陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.MW756209.GCTATACGGGTTCGATCATCTTTTCAGGAAGGTATATCCCTAGTACTCAAGAAAAGCATGTTTCTAAATTTTCCCAACCTATTACCCTATCCGCAGGATCTTTAGTTTTAGAAAAAGGAC.5支氣管敗血波氏桿菌陽性對照參考序列（GenBankAccessionNo.LR134480ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCAGTGCGGGACAAGGCGGCGATCAACACGCCGAGATAGACATCGAGTGCGATCAACCACTGCAGGATCAATGACTCAGGCTCGAGACGAGCACGCCACCTGCATTTTCTTCAAA9反應體系RT-RAA熒光反應單元（25μL凍干粉）-正向引