T-AHFS 006-2024 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測（聚合酶螺旋反應(yīng)法PSR）

速檢測（聚合酶螺旋反應(yīng)RapidmethodforthedetectionofListeriamonocytogenesandStaphylococcusaureusinfoods(polymerasespiralreaction,PSR)2024-09-19發(fā)布2024-10-19實(shí)施I省食品藥品檢驗(yàn)研究院、馬鞍山市食品藥品檢驗(yàn)和藥品不良媛、曹品品、段佳麗、吳鵬、安虹、汪強(qiáng)、王1食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測（聚合酶螺旋反應(yīng)法，PSR）本文件規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的聚合酶螺旋反本文件適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的快GB4789.10食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌GB4789.30食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分3.1聚合酶螺旋反應(yīng)（Polymerasespiralreactio活性的BstDNA聚合酶，可在恒溫條件下完成對靶基因的快且不需昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而取得良好的應(yīng)用效果。其體系內(nèi)包含：Tris-HCl、硫酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、DNA：脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosTris：三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomeHNB：羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphtholb恒溫65℃下反應(yīng)30-60min即可完成擴(kuò)增。基本擴(kuò)增原理為：在高濃度甜菜堿的作用下，誘導(dǎo)DNA單鏈和雙鏈之間處于動(dòng)態(tài)平衡。此外，利用BstDNA26.1冰箱：冷藏溫度（2℃-4℃)、冷凍溫度（-20℃)。1Listeriamonocytogenes23Escherichiacoli45Salmonellaenteritidis6Salmonellatyphimuri7Shigellaflexneri89Tween20）；硫酸鎂（100mM，RG）；dNTP（10mM）；甜菜堿（5M，RG）；DNA聚合酶（8,000U/mL）；Evegreen（20×);羥基萘酚藍(lán)指示劑（3mM）。細(xì)菌DNA提取試劑盒，包括細(xì)菌DNA提取試劑、溶菌酶、RNase和3食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的PSR快速檢測程序，圖1食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃9.1樣品制備、增菌培養(yǎng)將質(zhì)控菌株富集為菌懸液并直接提取核酸，核酸濃度為20ng/μL-100ng/9.1.2方法二樣品中致病菌的檢測參照國標(biāo)GB4789.30取樣方法，取25g（mL）待測樣品，并將其置于盛有（附錄B）的錐形瓶中，在36℃±1℃,180rpm條件下培養(yǎng)8h9.2核酸提取49.2.2利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒速引物（IF、IB附錄A.2）。反應(yīng)體系其余試劑和濃度不變。12甜菜堿（5M）345678-9--9.3.2擴(kuò)增程序65℃金屬浴反應(yīng)45min，再在85℃下反應(yīng)2min（使酶滅活），即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。9.4.1實(shí)時(shí)熒光檢測（a）自反應(yīng)開始每隔60s收集一次熒光信號(hào)，該階段循環(huán)45次，即反應(yīng)45min（循環(huán)階段沒有擴(kuò)增曲線則判定為陰性，即該樣本不含有對應(yīng)檢測9.4.2瓊脂糖凝膠電泳檢測加入4μL4SGreenPlus無毒核酸染料，輕晃溶液使核酸染料與瓊脂糖混合均勻，隨后倒入安有對應(yīng)檢測項(xiàng)目的核酸；泳道內(nèi)無階梯狀條帶產(chǎn)生則為陰性，即59.4.3羥基萘酚藍(lán)顏色指示劑在反應(yīng)體系中加入1μL羥基萘酚藍(lán)顏色指示劑，3min中內(nèi)反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液為藍(lán)色則為陽性；反應(yīng)檢測過程中分別設(shè)三個(gè)空白對照、陰性對照、陽性對照。空白對照以滅菌水替代DNA模板；（a）空白對照：反應(yīng)時(shí)間45min內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光法無熒光信號(hào)檢出；凝膠電泳（b）陰性對照：反應(yīng)時(shí)間45min內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光法無熒光信號(hào)檢出；凝膠電泳11.1結(jié)果為陰性，表述為“未檢出單核細(xì)胞增生李斯11.2結(jié)果為陽性，表述為“單核細(xì)胞增生李斯特氏菌/金黃色葡萄球菌初篩陽性”，陽性樣本按GB6A.1細(xì)菌DNA提取試劑盒與聚合酶螺旋擴(kuò)123412345A.2聚合酶螺旋擴(kuò)增所使用的引物固定體系與引物序列序列5’-3’CCTCTTTGCGTATTGCCCTTGCTGGCATATGTTTCCCGTTATGCGTTTCTCCTACGCCATTATCTTTTTACAGGGAGAACATCTATTTCGAGCCTTCTACAAGAGGGACATTTTTACCGTTTGATTT7A.3聚合酶螺旋擴(kuò)增的目標(biāo)靶序列ATGACAGAATACTTATTAAGTGCTGGCATATGTATGGCAATCGTTTCAATATTACTTAGGCTATCAGTAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTTTTTCTATTTCGCTACTAGTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAGTATATAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAACCAATGACATTCAGACTATTATTGGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCAAAAAAAGAGAAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCACTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACACCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGAATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATAGTTGTACCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAAAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCATAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGGCGGCAACCTCGGAGACTTCGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATCATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGCGAAAACAATAAAAGCAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAAT8亞碲酸鉀2.5mg/L萘啶酮酸2mg/L將胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、大豆蛋白胨、氯化鈉加入990mL水中，加熱溶解后冷卻至室溫，