流感病毒的紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗技術(shù)操作規(guī)

范

流感病毒的血凝素(HA)能夠引起多種禽類和哺乳動物

的紅細胞發(fā)生凝集，因此而得名。用于檢測流感病毒滴度的

紅細胞凝集試驗也是根據(jù)病毒的這一特性而建立的。當血清

中特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，則可以抑制紅細胞凝集

的出現(xiàn)，即為紅細胞凝集抑制試驗(HI)的理論根據(jù)。

微量紅細胞凝集抑制試驗是目前最常用的一種鑒定流

感病毒型/亞型的方法。該方法簡單、易行、結(jié)果可信。用于

HI的標準參照血清必須及時更新，要包括當年的疫苗株和/

或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必須經(jīng)特殊處理以

去除非特異性抑制素及非特異性凝集素°

(一)生物安全要求

生物安全要求及個人防護要求與流感病毒的分離相同，

并應(yīng)遵守相應(yīng)的生物安全規(guī)定。

(二)實驗所用試劑

1.抗原：季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、

B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液

2.抗血清：經(jīng)RDE或者過碘酸鉀處理后的季節(jié)性

A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲

型H1N1流感病毒抗血清。

（三）其他試劑/材料/儀器（試劑盒中不包含）

1.紅細胞懸液

2.PBS緩沖液，PH7.4

3.水浴箱（37℃,56℃）

4.臺式離心機

5.多道可調(diào)加樣器

6.離心管

7.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細胞進行實驗須用

底板，使用雞/火雞紅細胞進行實驗最好用“V”底板，"U”

底板也可使用）、可調(diào)多通道加樣器、單道加樣器等。

8.200ul、lOOOulTIP頭、水槽

流感病毒紅細胞凝集試驗各項條件比較

人“0”

紅細胞雞火雞豚鼠

型血

終濃度0.50.50.750.75

孔底部

V型V型U型U型

形狀

孵育時

30min30min45min60min

問

紅細胞細胞沉積成點細胞沉積成點細胞沉細胞沉

沉積形狀，傾斜時細胞狀，傾斜時細胞積成環(huán)積成環(huán)

狀向下流成淚滴狀向下流成淚滴狀狀狀

(四)流感病毒鑒定步驟

1.紅細胞配置

如用火雞、雞的紅細胞，工作液濃度為1%,如用人“0”

型、豚鼠紅細胞，工作濃度為1.5%。下面介紹WHO流感參

比與合作中心提供的紅細胞標定的方法：

(1)S液中的紅細胞，120(h7min離心5min,棄上清。

(2)加入等量的PBS液體洗滌，充分混勻，1200i7min

離心5min,棄上清。

(3)PBS液體洗滌三次。最后一次洗滌后，1200r/min

離心lOmirio

(4)將紅細胞稀釋至合適的濃度。

注:A.S液全稱為Alsever氏液。配制方法為葡萄糖2.05g、

檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加

至100mL,微熱溶解，將pH值調(diào)到6.1,8磅20min高壓滅

菌，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.流感毒株HA滴度的測定

(1)在微量血凝板的第2?12列加入50ulPBS(PH7.4)o

(2)在第一列(Al?G1)中加入100ul病毒懸液。

(3)H1力口入lOOulPBS,作為紅細胞陰性對照。

（4）從第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列

做2倍系列稀釋，最后一列每孔棄去503。

（5）在每孔中加入503紅細胞懸液，輕拍血凝板，充分

混勻。

（6）室溫孵育，孵育時間見表：流感病毒紅細胞凝集試

驗各項條件比較。

3.HA試驗結(jié)果判斷

引起全部紅細胞凝集為完全凝集，以記錄；只有部分

紅細胞凝集記錄為“+/，；無凝集記錄“，。血凝滴度的判定以

出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病

毒的血凝滴度。

HA滴度判定舉例

病毒稀釋度HA

1:1:1:1:1:11:31:61:11:21:51:101:20滴

12486242856122448度

123456789101112

A++-------2

B++++--------8

C+++++-------16

D++++++------32

E+++++++-----64

F++++++++----128

>20

G++++++++++++

48

H--------<1

4.制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位的抗原

（1）一個凝集單位指能引起等量的標準化的紅細胞凝集

的病毒量。進行紅細胞凝集抑制試驗時一般用4個血凝單位

的病毒量。

（2）制備4個單位血凝抗原時，首先計算出紅細胞凝集

抑制試驗所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋，

每孔用抗原25ul,則測定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)標準

血清的份數(shù)（本試劑盒包含5種標準血清）計算出實驗所需

病毒抗原總量。

（3）其次，計算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以

8,得到的商即為配置4個血凝單位所需的稀釋度。如，某

病毒的HA滴度為64,除以8等于8,則1:8（1mL病毒液

加7mLPBS）稀釋該病毒即可得到4個血凝單位的抗原。

注：紅細胞凝集抑制試驗中所用的4個血凝單位是指每

25ul病毒液中含有4個血凝單位（等于50ul病毒液中含有8

個血凝單位）。

所需抗原總量為1600ul時，4個血凝單位配置對照表

HA滴度病毒液（ul）PBS(ul)

16800800

324001200

642001400

1281001500

256501550

512251575

102412.51587.5

20486.251593.75

5.4個血凝單位抗原的復(fù)核滴定

為了保證紅細胞凝集抑制試驗中抗原用量一致并且準

確無誤，新配置的4個血凝單位抗原需復(fù)核滴定。操作方法

同HA實驗步驟。

如果只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50ul病毒含有8個血

凝單位，該病毒稀釋準確，可以用于紅細胞凝集抑制試驗。

如第5孔也出現(xiàn)凝集，說明每50ul病毒含有16個血凝單位,

該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50ul病毒

僅含4個血凝單位，病毒量需加倍。止匕外，4個血凝單位抗

原必須每次用前新配置。

6.紅細胞凝集抑制試驗(HI)鑒定未知病毒

(1)在血凝板的每孔加入25U1PBS。然后在Al—A5、

A7—All各列分別加入：抗季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標準參

考血清、抗季節(jié)性A（H3N2）流感病毒標準參考血清、抗

B-Yamagata系流感病毒標準參考血清、抗B-Victoria系流感

病毒標準參考血清、抗新甲型H1N1流感病毒標準參考血清

25ul,A6、A12加入253PBS,作為陰性對照。用多道移液

器從A行每個孔分別取25ul,由A至H行做2倍稀釋血清,

最后一行棄去25ulo

（2）Al至A5各列每孔加入25ul待檢抗原（4個血凝單

位）陽性對照：A7至All各列分別加入4個血凝單位的季

節(jié)性A（H1N1）流感病毒標準參考抗原、季節(jié)性A（H3N2）流感

病毒標準參考抗原、B-Yamagata系流感病毒標準參考抗原、

B-Victoria系流感病毒標準參考抗原、新甲型H1N1流感病

毒標準參考抗原各25ul/孔。對照孔A6、A12各列加入25ul

PBS/孔。輕拍，混勻，室溫孵育30min。

（3）每孔加入50ul配置好的紅細胞懸液，輕拍混勻，室

溫孵育30-60min,觀察血凝抑制實驗結(jié)果。（具體孵育時間

根據(jù)使用的不同種血球來定，詳見表1。）

（4）血凝抑制效價是完全抑制血凝出現(xiàn)時血清的最高稀

釋度的倒數(shù)。

7.鑒定結(jié)果判定

（1）標準參照血清對待檢抗原的抑制效價220才可以

算為陽性。

（2）一種待檢抗原不能同時被兩種或兩種以上的標

準血清抑制。

（3）待檢抗原標準參照血清有交叉抑制，但與一種亞

型（B型流感稱為系）的標準參照血清抑制效價大于其他亞

型參照血清4倍以上時，便可以判定為此種亞型的流感病毒。

（五）注意事項

1.血紅細胞凝集抑制試驗必須用4個血凝單位/25ul的

抗原，抗原必須新鮮配制。

2.紅細胞懸液的配制必須標準化。

3.正確存放試劑，避免反復(fù)凍融及污染。

4.凍干的試劑應(yīng)按照說明溶解，保存。

5.任何待檢病毒與一種以上的推薦抗血清反應(yīng)，滴度明

顯大于20,可能的原因為：

（1）使用了不足4