DB12T 199-2004 以大豆為原料的醬油等發(fā)酵產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測方法

2004-07-28發(fā)布2004-07-28實(shí)施天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I用了歐盟推薦的檢測方法，項(xiàng)目編號(hào)為EU-ProjectSMT4-CT96-2072,方法編號(hào)為Brodmann,P.97c和Brodmann,P.97d,檢本標(biāo)準(zhǔn)由未津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心、中華人民共和國遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：金紅、趙昕、王永、程奕、鄭貴忠。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了醬油等液態(tài)發(fā)酵制品和豆腐乳等固態(tài)發(fā)酵制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱為PCR)檢測方法。2規(guī)范性引用文件修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T1194植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測的抽樣和制樣方法SN/T1204植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。物種本身不具有的、而是來源于其他物種的功能基因序列。模板基因序列先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以四種脫氧核糖核酸(dNTPs)為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延對(duì)樣品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，以判定該樣品是否3.4.1GMO:geneticallym3.4.2PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。3.4.3DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。3.4.4dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphate,脫氧核甘三磷酸。3.4.5Lectin:植物凝集素基因，為大豆本身含有的內(nèi)源基因。3.4.6CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。3.4.7NOS:TerminatorofnopalinesynthasegenefromAagrobacteriumtumefaciens,來源于農(nóng)桿菌的胭23.4.9GTS403-2:美國Monsanto公司的基因有CaMV3SS啟動(dòng)子，NOS終止子和CP4-EPSPS基因等。4防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。5抽樣和制樣按照SN/T1194中規(guī)定的方法進(jìn)行。6測定方法液態(tài)和固態(tài)大豆發(fā)酵制品經(jīng)過提取DNA后，根據(jù)加工用的轉(zhuǎn)基因大豆原料所插入的外源基因設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，特異性擴(kuò)增外源基因的DNA片斷，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，判6.2.1電子天平(感量分別為0.01g和0.0001g)。6.2.3低溫超速離心機(jī)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)。6.2.4研缽及粉碎裝置。6.2,5普通冰箱，超低溫冰箱。6.2.9微量移液器(0.1~2.5HL,1~10HL,10~100HL,100~1000A)。6.2.12凝膠成像分析系統(tǒng)或紫外透射分析儀。6.2.15液氮罐6.3試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水為I級(jí)。6.3.2三羥甲基氨基甲烷(Tris)。6.3.3二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na:2H?O)。6.3.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3.5三氯甲烷。6.3.8三氯甲烷：異戊醇=24:1(體積比)。36.3.970%乙醇和無水乙醇。g,PVP20g,用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0。6.3.12氯化鈉溶液(1.2mol/L):1000ml水中溶解70g。6.3.13乙酸鈉溶液(3mol/L):800408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2,加水定容至1L。6.3.14Tris-HCl溶液(0.1mol/L,pH8.0):800ml水中溶解12.114gTris,冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0,定容至1L。6.3.17dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液：各2.5mmol/L。6.3.18Taq酶：2U/HL。6.3.25GTS40-3-2轉(zhuǎn)基因大豆陽6.3.27濾芯吸頭(10HL,20HL,100HL,200HL,1000HL)。6.3.28PCR反應(yīng)管(200HL)。6.3.30引物：轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因和外源基因檢測時(shí)所用的引物序列見表1。表1轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因和外源基因的引物序列檢測基因基因性質(zhì)內(nèi)源基因外源基因外源基因外源基因品系鑒定取醬油等液態(tài)發(fā)酵樣品30mL,加入60mL無水乙醇(6.3.9)混勻，置超低溫冰箱(-20℃)放置10min后，取出在4C10000r/min離心10min,棄上清，在沉淀中加入30mL0.1MTris-HCI溶液 (6.3.14),用力搖勻，全部轉(zhuǎn)移至100mL燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌2小時(shí)，室溫12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀用于DNA提取。取固態(tài)發(fā)酵樣品5g,置預(yù)冷研缽中，加液氮(6.3.29)研磨成粉末，轉(zhuǎn)入50mL離心管中，用于6.4.1.2CTAB法提取DNA取經(jīng)預(yù)處理的樣品加入10mL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(6.3.10),搖勻。65℃水浴1小時(shí)，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次，取出靜置冷卻至室溫，12000r/min離心12min,取上清，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇(6.3.8)緩慢顛倒搖勻5min,10000r/min離心10min,取上清，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇(6.3.8)重復(fù)抽提一次，取上清，加入2倍體積的CTAB沉淀液(6.3.11),搖勻，室溫靜置1小時(shí)，12000r/min離心10min,棄上清，沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液(6.3.12)1mL溶解沉淀，室溫靜置5min,加入等體積三氯甲烷+異戊醇(6.3.8)顛倒搖勻1min,12000r/min離心10min,取上清，加入10%的3mol/L乙酸鈉(6.3.13)和等體積的冷異丙醇(6.3.7),緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000r/min離心15min,棄上清，加入400HL70%冷乙醇(6.3.9)洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，待沉淀干燥后，加入30LL滅菌的去離子水溶解DNA(6.3.19)沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.2樣品中DNA質(zhì)量的鑒定采用內(nèi)源基因擴(kuò)增法鑒定所提取的樣品DNA的質(zhì)量。通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增大豆內(nèi)源基因。6.4.3.1PCR反應(yīng)體系檢測以大車為原料的發(fā)酵制品中內(nèi)源基因和外源基因采用的PCR檢測體系見表2。反應(yīng)體系中各試劑的量根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每個(gè)反應(yīng)體系應(yīng)該設(shè)置兩個(gè)平行管。10×PCR反氯化鎂(25(各正向引物(反向引物(Taq酶(2U模板(樣品的D水6.4.3.2反應(yīng)體系對(duì)照的設(shè)置進(jìn)行PCR檢測時(shí)反應(yīng)體系必須設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽性對(duì)照：用轉(zhuǎn)基因大豆材料中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的DNA模板；陰性對(duì)照：用非轉(zhuǎn)基因大豆材料中提取的DNA為6.4.3.3樣品中內(nèi)源基因和外源基因的檢測以大豆為原料的樣品的內(nèi)源基因和外源基因的PCR檢測的參考反應(yīng)條件見表3。反應(yīng)條件需根據(jù)因擴(kuò)增最后延伸5S9用1×TAE電泳緩沖液制備2%的瓊脂糖凝膠(凝膠融化后晾至60℃左右時(shí)加入溴化乙錠，含量為合適的DNA分子量標(biāo)記物，選擇合適的電壓(3V/cm~5V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40min~606.4.3.5凝膠成像分析(照相)電泳結(jié)束店，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成增出的目的條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。對(duì)于大豆特異性內(nèi)源基因Lectin片段的檢測，如果陰性對(duì)照、待測樣品和陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物都出現(xiàn)118bp的條帶，則表明提取的待測樣品DNA符合PCR反應(yīng)的要求，能用于外源基因的檢測；否則不能用于檢測外源基因，應(yīng)該重新提取待測樣品DNA,直到能擴(kuò)增出118bp的條帶，防止檢測中產(chǎn)對(duì)待測樣品DNA提取液進(jìn)行外源基因的PCR檢測，如果陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，陽性對(duì)照和待測樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可判斷待測樣品中含有外源基因。對(duì)醬油等發(fā)酵制品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，可參考表1的內(nèi)容，先篩選檢測CaMV35S、NOS基因，若篩選檢測結(jié)果陽性，則需進(jìn)一步鑒定檢測外源目的基因片段CP4EPSPS和P-35S/CTP,如果外源基因CP4EPSPS和P-35S/CTP的擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)也