（高清版）DB62∕T 4634-2022 牛結(jié)節(jié)性皮膚病血清學(xué)診斷技術(shù)

DB62/T4634—2022牛結(jié)節(jié)性皮膚病血清學(xué)診斷技術(shù)2022-10-20實(shí)施2022-10-20實(shí)施本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由甘肅省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本文件由甘肅省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、靜寧縣畜牧獸醫(yī)中心。本文件主要起草人：景志忠、高建平、唐豪、陳國(guó)華、張勇、房永祥、何小兵、景偉、李維克、賈懷杰、婁忠子、張春祥、付寶權(quán)。I本文件規(guī)定了牛結(jié)節(jié)性皮膚病的血清學(xué)診斷方法及其綜合判定。本文件適用于牛結(jié)節(jié)性皮膚病的快速診斷、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T39602牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷技術(shù)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存和運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。牛結(jié)節(jié)性皮膚病lumpyskindisease(LSD)又名牛疙瘩皮膚病，是由痘病毒科脊椎動(dòng)物亞科山羊痘病毒屬的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LSDV)感染牛引起的一種傳染病，主要由吸血節(jié)肢動(dòng)物傳播，其臨床特征主要為發(fā)熱，皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官表面的廣泛性結(jié)節(jié)，淋巴結(jié)腫大，動(dòng)物消瘦，產(chǎn)奶量降低，不孕、不育和流產(chǎn)，以及無(wú)癥狀的隱性損傷和繼發(fā)感染等表現(xiàn)。4樣品采集與生物安全管理LSD臨床病例檢查與剖檢，診斷檢測(cè)樣品的采集、運(yùn)輸和處理按照GB/T39602和NY/T541執(zhí)行；實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)試驗(yàn)以及待檢樣品、培養(yǎng)物和廢棄物處理中的生物安全管理均按GB19489的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5病毒中和試驗(yàn)(VNT)MEM培養(yǎng)液，綿羊羔睪丸細(xì)胞(LTc),MDBK細(xì)胞，LSDV抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清，待檢血5.2方法12將log?06TCIDso/mL的山羊?qū)⒌?份滅活的待檢血清50μL分別加到微量滴定板A到H行的第1、第2列孔中，第2份血清加到第3、第4列孔中，第3份血清加到第5、第6列孔中，第4份血清加到第7、第8列孔中，陰性對(duì)照血清加到第9、第10列孔中，50μL不含血清的Eagle's/HEPES液分別加到第11、第12列以及H行的所有孔中。從G行開(kāi)始用最大稀釋度的病毒液50μL,加到該行的每個(gè)孔中。依加入到相應(yīng)行的各孔中，直到最小病毒稀釋物加到A行。從培養(yǎng)第3d開(kāi)始，在倒置顯微鏡下每天觀(guān)察單層細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)情況，直至第9d,H行細(xì)胞應(yīng)無(wú)CPE。以待檢血清最高稀釋度50%保護(hù)為該待檢血清中和效價(jià)，以能保護(hù)細(xì)胞免受感染的最6.1.1濃縮膠：由5%聚丙酰胺Tris(125mM,pH6.8)和SDS(0.1%)組成；6.1.2分離膠：由10%～12.5%聚丙酰胺Tris(560mM,pH8.7)和SDS(0.1%)組成；6.1.3甘氨酸電泳緩沖液：250mMTris、2M甘氨酸和0.1%SDS;6.1.4封閉液：3%BSA和0.05%Tween20PBS,或5%奶粉和0.05%Tween20PBS;DB62/T4634—206.1.6標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量marker,硝酸纖維素膜(NCM),病毒粒子抗原或重組蛋白抗原。將待檢血清，包括陽(yáng)性血清、陰性血清各1份，用封閉液1:50稀釋血清，56℃±0.5℃滅活30min后當(dāng)山羊痘病毒屬病毒感染LTc的CPE達(dá)到90%時(shí)收獲細(xì)胞，凍融三次，離心，取上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管，加病毒裂解液煮沸5min,作為組織培養(yǎng)的病毒粒子抗原。也可用體外表達(dá)的重組蛋白代替病毒粒子6.2.3SDS/PAGE分析將制備的病毒粒子抗原或重組蛋白抗原與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量marker同時(shí)分別上樣，加到SDSPAGE凝膠孔中，在甘氨酸電泳緩沖PBS充分沖洗，并用3%牛血清白蛋白PBS或5%脫脂奶粉PBS在旋轉(zhuǎn)振蕩器上4℃±0.5℃封閉過(guò)夜。將NCM按組別剪成數(shù)個(gè)紙條，用PBS在旋轉(zhuǎn)振蕩器上徹底沖洗5次，的血清(包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清)中在室溫下震蕩1.5h,再次充分洗滌NCM,并孵育在特定稀釋的辣震蕩孵育3min～7min,在NCM背景即將變色之前用PBS樣品不出現(xiàn)雜交條帶，表示試驗(yàn)成立。待檢血清樣品至少出現(xiàn)一條雜交帶即注：抗副痘病毒(牛丘疹性口炎或偽牛痘病毒)的高免血清可與LSDV的一些蛋白反應(yīng)，但不與32kDa蛋白反應(yīng)，以區(qū)7間接ELISA法pH9.6);7.1.3濃縮洗滌緩沖液(25×PBST)(89.5gNa?HPO412H?O,5gKH?PO?,5gKCl,200gNaCl,5mL3學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載47.1.4封閉緩沖液：0.02molL磷酸鹽緩沖液+3%BSA(0.2g磷酸二氫鉀，2.9g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，30gBSA,加去離子水定容到1000mL);7.1.52M終止液(111mL濃硫酸(H?SO?),899mLH?O,30μLProclin300)。用稀釋液對(duì)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG作1:20000稀釋(工作濃度為1:10000～1:20000),每取出微孔板，每孔加終止液(2mol/LH?SO?)50μL。7.3.1試驗(yàn)成立條件若陰性對(duì)照OD450值<0.3,陽(yáng)性對(duì)照OD?50值(P)>1.0,P/N值>3,則試驗(yàn)成立，結(jié)果有效。7.3.2S/N值計(jì)算每份待檢樣品的OD450值(S),除以參考陰性對(duì)照的OD450值(N),則得出每份待檢樣品的SN值。如果每份待檢樣品或陰、陽(yáng)性對(duì)照有多孔重復(fù)，則應(yīng)計(jì)算平均值后再計(jì)算S/N值。7.3.3判定標(biāo)準(zhǔn)待檢樣品的S/N≥2,則判定該樣品為陽(yáng)性；SN<2,則為陰性。8競(jìng)爭(zhēng)ELISA法8.1材料山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原，競(jìng)爭(zhēng)抗體工作液，鼠抗兔辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，LSDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，洗滌緩沖液(PBST),封閉緩沖液；TMB底物，2M終止液。8.2方法8.2.3抗原包被8.2.4競(jìng)爭(zhēng)抗體制備用PBS將山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原稀釋成200μg/mL,與弗氏完全佐劑按體積1:1混合，乳化后采用皮下多點(diǎn)注射免疫健康實(shí)驗(yàn)家兔，每只接種免疫1mL;第一次免疫間隔14d后，用第一次免疫相同的疫苗和劑量進(jìn)行第2次免疫；第二次免疫再間隔14d后，用加倍蛋白抗原與弗氏不完全佐劑疫苗進(jìn)行第3次免疫；用第三次免疫相同的疫苗和劑量進(jìn)行最后一次免疫，免疫接種后14d從家兔心臟采血，稀釋為競(jìng)爭(zhēng)抗體工作液。8.2.5加血清樣品取已包被抗原的酶標(biāo)板，每次檢測(cè)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照及空白對(duì)照孔，其中標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照設(shè)2孔，陰性血清對(duì)照設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)血清(陽(yáng)性或陰性對(duì)照血清)50μL/孔；空白對(duì)8.2.6加競(jìng)爭(zhēng)抗體56用稀釋液(即洗滌液)對(duì)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG作1:8000稀釋(工作濃度為1:1000~