【辰輝創(chuàng)聚生物】HIF-2α蛋白技術(shù)概述：科研試劑中的低氧通路關(guān)鍵因子

【辰輝創(chuàng)聚生物】HIF-2α蛋白技術(shù)概述：科研試劑中的低氧通路關(guān)鍵因子低氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF-2α），也稱為EPAS1（EndothelialPASDomain-ContainingProtein1），是一種在哺乳動物細胞中對氧氣濃度變化高度敏感的轉(zhuǎn)錄因子。作為HIF家族的重要成員，HIF-2α在細胞低氧應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮核心作用。隨著對低氧信號通路的研究不斷深入，HIF-2α的結(jié)構(gòu)和功能特性已成為基礎(chǔ)生命科學(xué)、細胞生物學(xué)、分子機制研究等多個方向的重要研究內(nèi)容。本技術(shù)文檔旨在從科研角度系統(tǒng)介紹HIF-2α蛋白的結(jié)構(gòu)特性、調(diào)控機制及其在體外實驗中的常見應(yīng)用場景，為科研人員在構(gòu)建實驗?zāi)Ｐ?、分析蛋白功能及篩選調(diào)控因子等方面提供參考。一、蛋白結(jié)構(gòu)與功能域HIF-2α蛋白為全長約870個氨基酸的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，屬于bHLH-PAS家族，具有典型的多個功能域：bHLH結(jié)構(gòu)域（basichelix-loop-helix）：位于N端，參與DNA結(jié)合與二聚化，是識別低氧反應(yīng)元件（HRE）的關(guān)鍵區(qū)域；PAS-A與PAS-B結(jié)構(gòu)域：調(diào)控與ARNT（芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白）的異源二聚體形成，同時是小分子配體結(jié)合位點，尤以PAS-B結(jié)構(gòu)域在構(gòu)象變化中尤為關(guān)鍵；ODDD結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependentdegradationdomain）：位于蛋白中段，在常氧狀態(tài)下被脯氨酰羥化酶修飾，隨后被VHL復(fù)合物識別并介導(dǎo)泛素化降解；轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（TAD）：分布在C端區(qū)域，負(fù)責(zé)與共激活因子（如CBP/p300）結(jié)合并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這種多功能結(jié)構(gòu)為HIF-2α提供了復(fù)雜的調(diào)控能力，使其能在不同氧環(huán)境下動態(tài)調(diào)節(jié)基因表達網(wǎng)絡(luò)。二、調(diào)控機制與二聚體形成在常氧條件下，HIF-2α蛋白的兩個關(guān)鍵脯氨酸位點（Pro405和Pro531）被脯氨酰羥化酶（PHD）修飾，從而暴露出VHL識別位點。隨后，VHL泛素連接酶復(fù)合物介導(dǎo)其多泛素化并靶向蛋白酶體降解。而在低氧環(huán)境下，羥化過程被抑制，HIF-2α得以穩(wěn)定積累并轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，與ARNT形成異源二聚體。該復(fù)合物隨后結(jié)合DNA中含有HRE序列的靶基因啟動子，啟動多種與低氧應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序。在實驗設(shè)計中，研究者通常使用重組HIF-2α與ARNT蛋白構(gòu)建體外二聚體系統(tǒng)，以研究其在低氧條件下的信號級聯(lián)反應(yīng)，是探索HIF通路機制不可或缺的工具之一。三、科研試劑中的應(yīng)用場景在科研層面，重組HIF-2α蛋白常被應(yīng)用于以下多個方向，支持各類體外分析與機制研究：1.DNA結(jié)合實驗利用EMSA（電泳遷移率分析）或DNApull-down實驗，檢測HIF-2α對HRE序列的結(jié)合能力。研究者可使用標(biāo)記探針與重組蛋白共同孵育，以觀察結(jié)合遷移帶。2.蛋白互作分析HIF-2α可與ARNT、VHL、p300等蛋白形成復(fù)合物。重組蛋白常被用于GSTpull-down、免疫共沉淀（Co-IP）或表面等離子體共振（SPR）實驗，以定量或定性分析蛋白-蛋白間的結(jié)合親和力和區(qū)域。3.小分子結(jié)合與篩選PAS-B結(jié)構(gòu)域可作為小分子配體結(jié)合的熱點區(qū)域，適用于熒光偏振（FP）、AlphaScreen、等溫滴定量熱（ITC）等高通量篩選方法。科研人員可利用重組HIF-2α蛋白篩選其穩(wěn)定劑、抑制劑或構(gòu)象調(diào)節(jié)因子。4.轉(zhuǎn)錄活性構(gòu)建通過與共激活因子共表達或重組，HIF-2α可構(gòu)建入體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，分析特定靶基因啟動子區(qū)的活性響應(yīng)，常配合熒光素酶報告系統(tǒng)使用。5.結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究為了明確其在氧調(diào)控和小分子結(jié)合過程中的結(jié)構(gòu)變構(gòu)過程，科研人員通常重組表達PAS-B單域蛋白進行X-射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）或冷凍電鏡（Cryo-EM）分析。該方法可用于精確解析結(jié)合口袋與抑制機制，是結(jié)構(gòu)設(shè)計與機理研究的基礎(chǔ)。四、科研優(yōu)勢HIF-2α作為一種氧濃度響應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其重組形式為科研提供了精準(zhǔn)、可控且復(fù)現(xiàn)性高的實驗工具，主要優(yōu)勢包括：實驗條件穩(wěn)定、避免低氧培養(yǎng)的技術(shù)干擾；支持片段表達與全長構(gòu)建，適用于不同實驗?zāi)康?；可在細胞外重建HIF信號網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建模塊化體外系統(tǒng)；有助于靶點篩選、結(jié)構(gòu)功能分析及突變驗證。五、常見研究物種與標(biāo)簽形式人源HIF-2α蛋白（recombinanthumanHIF-2αprotein）為最常用表達形式，也有小鼠、大鼠來源蛋白。常見標(biāo)簽包括His、GST、Flag、Strep等，方便純化、捕獲和檢測?？蒲泄ぷ髦幸嘤惺褂霉δ苋笔蛔凅w（如ΔODDD）或結(jié)構(gòu)域表達體（如PAS-B）以滿足特定研究目的，這些構(gòu)建體通過體外系統(tǒng)更便于機制研究或篩選平臺搭建。參考文獻1.Scheuermann,T.H.etal.Allostericinhibitionofhypoxiainduciblefactor-2αbyasmallmolecule.Nat.Chem.Biol.9,271–276(2013).2.Wu,D.etal.StructuralbasisofHIF-2αrecognitionbysmallmolecules.Nature539,270–273(2016).3.Tarade,D.etal.HIF-2α–ARNTheterodimerizationinhibitors:evaluationusingAlphaScreen.J.Biol.Chem.293,13449–13463(2018).4.Sharma,S.etal.StructuralcharacterizationofHIF-2α–ARNT–DNAcomplexes.Nat.Commun.10,1031(2019).5.Cho,H.etal.On-targetefficacyofaHIF-2αantagonistinclearcellrenalcellcarcinoma.Nature539,107–111(2016).6.Shen,C.etal.Functionalanalysisoftheoxygen-dependentdegradationdomaininHIF-2α.CellRep.19,159–172(2017).7.Kim,B.W.etal.RoleofPAS-BdomainintheconformationalcontrolofHIF-2α.Structure28,1–12(2020).8.Rankin,E.B.&Giaccia,A.J.Hypoxiccontrolofmetastasis.Science352,175–180(2016).9.Loboda,A.etal.HIFsignalingpathwayanditsregulators.Int.J.Mol.Sci.23,378(2022).10.Soucy,T.A.etal.PharmacologictargetingoftheHIF-2α–ARNTinterface.Nat.Chem.Biol.15,357–366(2019).11.Ye,Y.etal.RecombinantHIFproteinsforfunctionalandstructuralstudies.Biochem.J.475,3021–3034(2018).12.Olcina,M.M.etal.HIF-2α:regulationandroleindevelopment.TrendsCellBiol.30,807–820(2020).13.Wang,V.Y.-F.etal.RegulationofHIF-2αinthenormoxicnucleus.Nature603,111–117(2022).14.Gordan,J.D.etal.HIF-2αpromotestumorcellp