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文檔簡(jiǎn)介

1、煙曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢查方法周艷(綜述)煙曲霉菌為空氣中常見(jiàn)的腐生菌,為一種機(jī)會(huì)致病真菌,其孢子直徑很小,可被動(dòng)吸入呼吸道,在一般的環(huán)境下,人們每天都能吸入上百個(gè)煙曲霉菌孢子,但是通常情況下都不致病。近20年來(lái)隨著廣譜抗生素的濫用、腫瘤放療和化療,造血干細(xì)胞移植術(shù)、實(shí)體器官移植術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物以及腸外營(yíng)養(yǎng)人數(shù)的增加以及艾滋病的流行等免疫抑制人群逐年增長(zhǎng)1,臨床上越來(lái)越多的免疫力低下的人群感染煙曲霉菌導(dǎo)致侵襲性肺曲霉?。╥nvasive pulmonary aspergillosis, IPA)。侵襲性曲霉菌感染的發(fā)病率日益增長(zhǎng),其發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)了最常見(jiàn)的真菌感染侵襲性念珠菌

2、病。免疫力低下的老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。IPA以肺部感染為主,主要為急性壞死性出血性肺炎,并可波及骨骼、腦、肝、腎、心臟等全身多個(gè)重要器官,其預(yù)后極差,死亡率高達(dá)80902。由于IPA的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,從而導(dǎo)致IPA的診斷極為困難,治療成功率很低。為此,發(fā)展有效的煙曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)室檢查方法對(duì)于該病的診斷與治愈顯得尤為重要,目前常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有:顯微鏡檢查、病原生物學(xué)培養(yǎng)方法、血清免疫學(xué)檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法等。本文就這些方法的研究作一綜述。關(guān)鍵詞:煙曲霉菌;聚合酶鏈反應(yīng);血清學(xué)診斷1、 顯微鏡檢查 顯微鏡檢查主要包括直接顯微鏡檢查和組織病理學(xué)檢查,都是以

3、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為基礎(chǔ)來(lái)對(duì)病原微生物進(jìn)行診斷。曲霉菌直接鏡檢呈現(xiàn)玻璃樣透明的菌絲,但是其菌絲結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的特異性并不突出,其他種類(lèi)相似的真菌如青霉菌亦可呈現(xiàn)類(lèi)似的鏡下特點(diǎn)。另一方面,組織病理學(xué)檢查雖也是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”,病理表現(xiàn)為真菌菌絲侵入和定植于組織或者血管造成炎癥改變。但是其報(bào)告總中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)曲霉樣形態(tài)學(xué)特點(diǎn)等描述性的診斷結(jié)果,這對(duì)在鏡下類(lèi)似曲霉菌類(lèi)的其他病原微生物的鑒別診斷帶來(lái)一定的困難,誤診的出現(xiàn)幾乎不可避免。若是發(fā)生誤診的兩種病原微生物的治療方案相差較大,就會(huì)嚴(yán)重影響治療效果,從而進(jìn)一步導(dǎo)致預(yù)后不良。此外,檢查者的主觀(guān)因素也有可能對(duì)診斷結(jié)論產(chǎn)生影響。2、 病原微生物的培養(yǎng)病原

4、微生物的培養(yǎng)是診斷細(xì)菌與真菌感染的常規(guī)方法,特異性高,同時(shí)還可以用于細(xì)菌與真菌感染的藥敏試驗(yàn),為臨床合理使用抗生素提供可靠的依據(jù)。標(biāo)本病原微生物的培養(yǎng)結(jié)果是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”,這是曲霉菌感染的診斷基礎(chǔ)3。煙曲霉菌培養(yǎng)是通過(guò)取病人血液、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、尿液及感染病理組織等標(biāo)本,接種于真菌培養(yǎng)基培養(yǎng),其中血液、BAL及感染組織為常用的取材標(biāo)本。各實(shí)驗(yàn)室采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度時(shí)間各有不同,如蔡氏培養(yǎng)基適用26培養(yǎng)3-4天,沙保培養(yǎng)基適用35培養(yǎng)1-2天,但因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)且敏感性不高,因而可能延誤病人的診斷和治療。與白色念珠菌、新型隱球菌等單細(xì)胞真菌比較,煙曲霉菌為絲

5、狀型真菌,組織的機(jī)械破碎對(duì)絲狀真菌成活力及培養(yǎng)有很大影響4。此外,由于曲霉菌是機(jī)會(huì)致病菌,從有菌區(qū)獲取的陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果并不能明確是由于定植的正常菌群或是侵襲性感染所致。3、血清免疫學(xué)檢測(cè)法 血清免疫學(xué)檢測(cè)法是一種診斷病原因子感染的經(jīng)典方法,原理是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)特異性的免疫學(xué)原理,檢查患者血清、腦脊液、BAL、尿液等體液標(biāo)本中病原因子特異的抗原或抗體。在煙曲霉菌感染血清學(xué)檢測(cè)法的研究報(bào)道中,眾多實(shí)驗(yàn)室研究的檢測(cè)法都是圍繞半乳甘露聚糖(GM)抗原而展開(kāi)的。有研究5結(jié)果提示:采用酶免疫測(cè)定法(EIA)檢測(cè)BAL標(biāo)本中煙曲霉GM抗原有利于早期診斷并且指導(dǎo)治療;閾值的設(shè)立對(duì)于EIA法的檢測(cè)結(jié)果敏感性和特

6、異性會(huì)有影響。從49名確診為侵襲性肺曲霉?。↖PA)的個(gè)體和50名疑為IPA的個(gè)體采集的BAL標(biāo)本,進(jìn)行GM EIA的檢測(cè),當(dāng)閾值設(shè)為1.0時(shí),敏感性為61%;檢測(cè)閾值為0.5時(shí),敏感性為76%;相應(yīng)的特異性分別為98%和94%。另外,從22名BAL標(biāo)本煙曲霉培養(yǎng)陰性病人獲取標(biāo)本做GM EIA測(cè)定,當(dāng)檢測(cè)閾值為1.0時(shí),敏感性為41%;檢測(cè)閾值為0.5時(shí),敏感性為59%6。還有實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)建立兔IPA模型,然后用GM EIA方法檢測(cè)分析。當(dāng)最佳閾值為0.75時(shí),未處理對(duì)照組的敏感性和特異性都達(dá)到100%;而抗真菌治療組敏感性下降到92%7。另外,該實(shí)驗(yàn)存在一定的假陽(yáng)性,也無(wú)法區(qū)別定植還是

7、感染。還有實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了一種基于檢測(cè)抗-Afmp1p抗原的抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法用于檢測(cè)煙曲霉感染。這種Afmp1p抗原是一種純化重組的煙曲霉細(xì)胞壁抗原GM蛋白。目前這種基于檢測(cè)抗-Afmp1p抗原的抗體的ELISA法的敏感性和特異性都比以前報(bào)導(dǎo)的基于檢測(cè)其他抗原的ELISA法高8-9。此外,有實(shí)驗(yàn)室發(fā)展生物芯片技術(shù)檢測(cè)GM效力用于評(píng)估前瞻性調(diào)查研究807例病人的3327例血清,特異性為99.6%,但對(duì)證明是或可能是曲霉病病人人群,敏感性卻只有50%,可能是本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的少量的假陽(yáng)性病例限制了實(shí)驗(yàn)的敏感性10。其中引起假陽(yáng)性的主要因素: (1)定植的曲霉釋放的GM進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)

8、;(2) 與其他許多真菌抗原出現(xiàn)交叉反應(yīng);(3) 使用環(huán)磷酰胺的潛在影響;(4) 交叉感染;(4) cut-off 值的影響等等。血清免疫學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)目標(biāo)的多樣化,加快了煙曲霉感染診斷的步伐,檢測(cè)閾值也急需各實(shí)驗(yàn)室之間規(guī)范化。除了上述幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室涉及的血清學(xué)診斷檢測(cè)目標(biāo)及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法,還有其他的檢測(cè)目標(biāo)如:galf抗原、BG11等等。4、分子生物學(xué)診斷聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分子生物學(xué)技術(shù)是一種新型的煙曲霉感染診斷方法,診斷的靈敏性高,越來(lái)越被人們所關(guān)注。目前成了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),其技術(shù)的關(guān)鍵部分有聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 擴(kuò)增、DNA 分子探針、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析( RFLP)

9、 、隨機(jī)擴(kuò)增DNA 多態(tài)性(RAPD) 等方法,其中PCR法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),因此,歐洲和美國(guó)FDA 推薦其用來(lái)診斷IPA,也被稱(chēng)為目前最理想的分子生物學(xué)方法。PCR診斷的檢測(cè)標(biāo)本有血清、腦脊液、BAL、尿液等,檢測(cè)靶基因各實(shí)驗(yàn)室各有不同,檢測(cè)方法也在不斷改進(jìn),由開(kāi)始的普通PCR、半定量PCR、定量PCR到實(shí)時(shí)PCR到定量實(shí)時(shí)PCR、巢式PCR等等12。PCR檢測(cè)體系的靶基因主要包括煙曲霉菌一些基因位點(diǎn)的保守序列或是線(xiàn)粒體 DNA 片段。首先將標(biāo)本中可能存在的煙曲霉菌DNA 提取出來(lái),利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 將其擴(kuò)增得出初始標(biāo)本中的曲霉菌 DNA 拷貝數(shù)或

10、是利用傳統(tǒng)PCR將其擴(kuò)增后,利用其他分析方法對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行分析,從而得到初始標(biāo)本中的曲霉菌的量和種類(lèi)等相關(guān)信息。PCR診斷技術(shù)類(lèi)似于煙曲霉DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。有實(shí)驗(yàn)研究表明:從49名已證明為侵襲性肺曲霉病(IPA)病人和50名可能為IPA病人獲取BAL標(biāo)本,靶基因?yàn)闊熐拐婢?19 bp片段長(zhǎng)度18s rRNA基因,采用定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)的敏感性和特異性分別為67%和100%。另外,從22名BAL標(biāo)本煙曲霉培養(yǎng)陰性病人獲取標(biāo)本做定量PCR檢測(cè),敏感性為36% 13 。還有實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)建立兔IPA模型,然后用定量實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行分析,

11、未處理對(duì)照組敏感性和特異性分別為80%和100%,而抗真菌治療組的敏感性降低到50%14。M. Hummel和 B. Spiess等采用一種巢式PCR方法測(cè)定病人腦脊液曲霉DNA,靶基因?yàn)闊熐拐婢?38 bp片段長(zhǎng)度18s rRNA基因,敏感性和特異性很高。他們嘗試用巢式PCR檢測(cè)曲霉病病人的腦脊液標(biāo)本來(lái)確定是否有曲霉DNA,這種方法曾經(jīng)在臨床和實(shí)驗(yàn)上檢測(cè)血液和BAL很有效。雖然腦脊液曲霉病診斷很困難,讓人振奮的是使用巢式PCR檢測(cè)6個(gè)腦脊液曲霉病病人標(biāo)本都為陽(yáng)性,敏感性100%15。Cathal E. OSullivan和 Miki Kasai等發(fā)展了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET

12、)的煙曲霉特異性定量實(shí)時(shí)PCR法,檢測(cè)標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)兔IPA模型BAL和肺組織,靶基因?yàn)?.8s區(qū)域基因。FRET定量實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)煙曲霉DNA有很高的敏感性和特異性,在不久的將來(lái)將用人類(lèi)標(biāo)本進(jìn)一步評(píng)估測(cè)定該方法16。Catriona Halliday和 Qi Xuan Wu等發(fā)展了一種巢式定性實(shí)時(shí)PCR方法用于探測(cè)臨床標(biāo)本中曲霉物種的DNA,這種檢驗(yàn)方法比實(shí)時(shí)PCR法敏感性高,并且應(yīng)用了低循環(huán)控制PCR系統(tǒng),從而又進(jìn)一步節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間17。Cornelia Lass-Florl Eberhard Gunsilius和Jason P. Trama等研究表明:抗真菌治療開(kāi)始后,全血標(biāo)本用于做PCR

13、診斷的優(yōu)點(diǎn)被限制,敏感性降低18,19,因此,組織標(biāo)本被推薦做曲霉PCR檢測(cè)。Cornelia Lass-Florl和Eberhard Gunsilius等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶基因是一個(gè)高度保守序列多拷貝18s rRNA。抗真菌治療后,病人血標(biāo)本用來(lái)證明病人感染曲霉的PCR敏感性閾值只需40%,而肺組織仍需100%19。Kaisu Rantakokko-Jalava和 Sanna Laaksonen等發(fā)展了一種探測(cè)BAL和組織病理標(biāo)本中煙曲霉線(xiàn)粒體DNA的實(shí)時(shí)PCR方法。伴隨定性檢測(cè),該方法診斷敏感性為73%,特異性為93%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為73%,陰性預(yù)測(cè)值為95%20。除了上面簡(jiǎn)單介紹的幾種PCR方法

14、,還有自動(dòng)化重復(fù)序列PCR(rep-PCR)21,酶免疫測(cè)定PCR22,快速高通量多路徑實(shí)時(shí)PCR23等等.各實(shí)驗(yàn)室采用各種改良PCR技術(shù),通過(guò)獲取臨床病例或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,分析不同檢測(cè)標(biāo)本如血清、腦脊液、BAL、尿液等等,檢測(cè)各個(gè)靶基因,檢測(cè)閾值不同,檢測(cè)敏感性和特異性也各有不同。值得注意的是,由于PCR易受呼吸道曲霉定植和空氣中存在的曲霉孢子的污染、不能判斷是活菌還是死菌、某些抗凝血藥、DNA 釋放的非連續(xù)性以及實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤差,這些問(wèn)題往往限制了PCR方法在IPA 診斷中的使用24??傊?,PCR診斷技術(shù)是一項(xiàng)快速、敏感、特異性好的診斷技術(shù),對(duì)煙曲霉感染的輔助診斷很有意義。但是因?yàn)楦鲗?shí)

15、驗(yàn)室采用的檢測(cè)方法不一,檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源及靶基因也各有不同,以及采集標(biāo)本來(lái)自抗真菌治療病人等等影響了煙曲霉感染PCR診斷的重現(xiàn)性和可靠性。為此,我們迫切需要煙曲霉感染PCR診斷技術(shù)的實(shí)驗(yàn)規(guī)范化。PCR法的檢測(cè)結(jié)果與真菌感染之間的關(guān)系、臨床診斷價(jià)值以及指導(dǎo)臨床抗真菌治療作用方面,有待進(jìn)一步研究。5、其他的診斷方法 除了上述四種煙曲霉感染診斷的常用方法,還有其他的一些診斷方法用于煙曲霉感染的診斷,如:活檢組織菌絲顯影法,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)現(xiàn)象分析法(AFLP25,BG試驗(yàn)法3等。伴隨煙曲霉感染診斷技術(shù)的不斷改良,快速、敏感、特異地診斷煙曲霉感染越來(lái)越被人們所關(guān)注。各實(shí)驗(yàn)室在改良實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí),通過(guò)各種實(shí)

16、驗(yàn)技術(shù)的結(jié)合用于煙曲霉感染的診斷,互補(bǔ)各實(shí)驗(yàn)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。如:Andrea Francesconi和 Miki Kasai等研究表明應(yīng)用GM EIA和定量實(shí)時(shí)PCR合并診斷BAL標(biāo)本中煙曲霉菌特異性抗原和DNA能提高檢測(cè)的敏感性和特異性,減少診斷時(shí)間,從而早期正確使用抗真菌藥物,改善煙曲霉菌感染,并且可以防止診斷陰性結(jié)果病人的濫用抗真菌藥物7。Birgit Spiess和Dieter Buchheidt等建立了一種低循環(huán)控制實(shí)時(shí)PCR,其測(cè)定方法快速、敏感、特異,能定量化檢測(cè)高危病人BAL標(biāo)本和血標(biāo)本中煙曲霉DNA。這是一種結(jié)合了實(shí)時(shí)PCR和低循環(huán)控制PCR的新型檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)PCR的敏感性比

17、低循環(huán)控制PCR好,但后者用于檢測(cè)真菌荷載比前者好,兩種PCR方法相結(jié)合而成的低循環(huán)控制實(shí)時(shí)PCR法值得我們關(guān)注6。Catriona Halliday和 Qi Xuan Wu等結(jié)合實(shí)時(shí)PCR和巢式PCR并應(yīng)用低循環(huán)控制PCR系統(tǒng)發(fā)展了一種巢式定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)。這種新型檢測(cè)煙曲霉感染的PCR技術(shù)因?yàn)榻Y(jié)合了巢式PCR技術(shù)比普通實(shí)時(shí)PCR技術(shù)敏感性高,并且比傳統(tǒng)的巢式PCR技術(shù)快速17。Svetlana Challier和Stephanie Boyer等發(fā)展了一種檢測(cè)血清煙曲霉菌DNA的特異性實(shí)時(shí)PCR技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)能提高侵襲性曲霉病的診斷率26。Cornelia Lass-Fl

18、orl和 Eberhard Gunsilius等評(píng)價(jià)抗真菌藥物治療期間全血標(biāo)本的PCR閾值時(shí)發(fā)現(xiàn):一旦標(biāo)本來(lái)源于抗真菌藥物治療后病人,PCR診斷的優(yōu)點(diǎn)被限制,因此推薦結(jié)合使用真菌培養(yǎng)法和顯微鏡檢查法提高真菌檢測(cè)的敏感性19。結(jié)語(yǔ)隨著臨床上煙曲霉感染發(fā)病率的增多,并且預(yù)后極差,死亡率高達(dá)8090,迫切需要發(fā)展一種快速、敏感、特異、規(guī)范化的診斷技術(shù)致力于早期發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌感染,早期治療煙曲霉感染,以及防止陰性感染結(jié)果病人的抗真菌藥物濫用。隨著對(duì)曲霉菌菌體抗原結(jié)構(gòu)的不斷研究,不排除在未來(lái)能夠發(fā)現(xiàn)更具有特異性的曲霉菌抗原成分,并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新型的血清學(xué)與分子生物學(xué)檢測(cè)方法, IPA 的診診斷技術(shù)的會(huì)得

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