2018微生物檢驗(yàn)技術(shù)師考點(diǎn)

1、 1.儀器的標(biāo)識(shí)管理：紅（停用）黃（準(zhǔn)用）綠（合格）各自所表明的狀態(tài)。2.分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)菌濃度用可見(jiàn)光分光光度計(jì)，測(cè)細(xì)菌波長(zhǎng)用。檢測(cè)蛋白用紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)用），它也可測(cè)核酸濃度（波長(zhǎng)）。選定分光光度計(jì)測(cè)定顏色反應(yīng)光的波長(zhǎng)是。石英比色皿用于紫外分光光度計(jì)，玻璃比色皿用于可見(jiàn)光分光光度計(jì)。 3紫外透射儀 該儀器使用條件是暗室和紫外線，主要用于在紫外線下看條帶。 4色譜氣相色譜可做微生物分類(lèi)和鑒定，用于微生物的化學(xué)成分分析。液相色譜儀也可做微生物化學(xué)成分分析。質(zhì)譜儀也可做微生物化學(xué)成分分析。 5測(cè)序儀蛋白測(cè)序儀測(cè)定氨基酸排列順序，測(cè)序儀是測(cè)核苷酸排列順序。能做測(cè)序的物質(zhì)是質(zhì)粒、噬菌體、產(chǎn)物。

2、6擴(kuò)增儀 是聚合酶鏈反應(yīng)縮寫(xiě)，能做稱(chēng)擴(kuò)增儀。它能以一定片段為模板，變換溫度，擴(kuò)增該片段。常用的“槍”是實(shí)驗(yàn)室常用的微量可調(diào)移液器。 7酶標(biāo)做的儀器稱(chēng)酶標(biāo)儀，做反應(yīng)，其中主要設(shè)備有塑料凹孔板、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。8.電泳類(lèi)別 醋酸纖維膜電泳可用于免疫球蛋白鑒定，瓊脂免疫電泳用于蛋白分離和鑒定，對(duì)流免疫電泳可測(cè)抗原或抗體，火箭電泳測(cè)抗原量，交叉定量免疫電泳測(cè)抗原量。是等電聚焦電泳。是脈沖電場(chǎng)凝膠電泳，是聚丙烯酰胺凝膠電泳。9. 用于蛋白和核酸分離，原理是凝膠介質(zhì)形成立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩和電泳作用。分離條帶上邊是大分子，下邊是小分子物質(zhì)。過(guò)硫酸銨在制備起催化聚合作用。是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝

3、膠電泳，它用于蛋白分離，在此電泳中，丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越??；該物濃度越小，線性分離范圍越大，十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)識(shí)測(cè)驗(yàn)電泳條帶分子量。在中常用蛋白染料是考馬斯亮藍(lán)，硝酸銀也是其常用染料。該電泳中緩沖液重要成分為甘氨酸。 10、等電聚焦電泳 其原理是以?xún)尚噪娊赓|(zhì)制造凝膠有不同，使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點(diǎn)停留。 兩性電解質(zhì)是制備該電泳凝膠不同重要物質(zhì)，用聚丙烯酰胺制備等電聚焦電泳凝膠。這種電泳主要用于蛋白質(zhì)分離。 11、脈沖電泳 脈沖電泳用于核酸分離，其優(yōu)點(diǎn)是分離大片段核酸。用瓊脂糖制備該電泳凝膠的介質(zhì)。這種電泳的電場(chǎng)為正交的交變脈沖電場(chǎng)。脈沖電場(chǎng)凝

4、膠電泳條帶靠近負(fù)極為大片段，靠近正極為小片段。染色可用溴化乙錠，也可用硝酸銀。因溴化乙錠有致癌作用，故在使用時(shí)應(yīng)注意。丙烯酰胺具有神經(jīng)毒，在用時(shí)注意個(gè)人防護(hù)。 12、瓊脂糖凝膠電泳 此電泳用于核酸分離與純化，用水平電泳槽。分離片段最佳范圍為。13、聚丙烯酰胺電泳 該電泳通常用垂直電泳槽，分離片段是最佳范圍是。 14.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 19489-2004實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求根據(jù)生物因子對(duì)個(gè)體和群體的危害程度將其分為4級(jí)： 危害等級(jí)（低個(gè)體危害，低群體危害）不會(huì)導(dǎo)致健康工作者和動(dòng)物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等生物因子。 危害等級(jí)（中等個(gè)體危害，有限群體危害）能引起人或動(dòng)物發(fā)病，但

5、一般情況下對(duì)健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病原體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限。 危害等級(jí)（高個(gè)體危害，低群體危害）能引起人或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個(gè)體間傳播，或能用抗生素抗寄生蟲(chóng)藥治療的病原體。 危害等級(jí)（高個(gè)體危害，高群體危害）能引起人或動(dòng)物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人，或動(dòng)物與人，或人與動(dòng)物，或動(dòng)物與動(dòng)物之間傳播的病原體。15.保存的病原微生物菌（毒）種要按規(guī)定進(jìn)行登記、上報(bào)和核準(zhǔn)，實(shí)行雙人雙鎖管理和使用審批制度。 保存和使用各類(lèi)病原微生物菌（毒）種的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)具

6、備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和設(shè)施條件，并在二級(jí)以上生物安全柜中操作。細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室在污染情況超過(guò)許可程度時(shí)，通常采取甲醛熏蒸消毒。病毒篇 1.用于病毒分離的材料，無(wú)論是傳代病毒培養(yǎng)物，還是采自發(fā)病或死亡動(dòng)物的病料，都應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室作病毒分離或鑒定。組織細(xì)胞或動(dòng)物接種和傳代可以應(yīng)用于病毒的分離和鑒定。病毒對(duì)細(xì)胞的感染性具嚴(yán)格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細(xì)胞接種病毒必須首先選擇敏感細(xì)胞。 （1）病毒增殖的判定：病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體和組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，顯然都會(huì)影響機(jī)體和細(xì)胞的代謝和生命活動(dòng)，并且經(jīng)常通過(guò)一定的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)變化表現(xiàn)出來(lái)。 （2）細(xì)胞病變（CPE）：大部分病毒在敏感細(xì)胞系均可出現(xiàn)CPE，CPE

7、可以表現(xiàn)為嚴(yán)重的細(xì)胞破壞、細(xì)胞腫大、顆粒增多、細(xì)胞融合成合胞體或無(wú)明顯的細(xì)胞變化等。CPE經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因此常常作為病毒鑒定的依據(jù)之一。（3）病毒蝕斑（又稱(chēng)空斑）技術(shù)：病毒蝕斑是指病毒在已長(zhǎng)成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中感染病毒含量的測(cè)定。（4）病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有兩種方法，一種方法是用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定LD50（半數(shù)致死量），另一種方法是在組織細(xì)胞上測(cè)定TCID50（半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量）。（5）病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過(guò)冷凍干燥后可以長(zhǎng)期保存。 2病毒形態(tài)學(xué)檢查 快速有效的標(biāo)本制作技術(shù)故然重要，但更需要識(shí)別病毒結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)。

8、病毒形態(tài)學(xué)檢查方法主要有： （1）光學(xué)顯微鏡 僅用于大病毒顆粒（如痘類(lèi)病毒）和病毒包涵體的檢查。 （2）電子顯微鏡檢查法 （3）超過(guò)濾法 用不同孔徑的火棉膠濾膜過(guò)濾病毒懸液，將獲得的濾液接種于組織細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或雞胚，或用血凝試驗(yàn)來(lái)測(cè)定病毒是否通過(guò)濾膜，從而估計(jì)病毒的大小。 （4）超速離心法 根據(jù)病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速離心法測(cè)得病毒的沉降系數(shù)（S），借以計(jì)算病毒的大小。 （5）X線晶體衍射法 但標(biāo)本必須為結(jié)晶，可用于無(wú)包膜病毒的研究。3免疫學(xué)鑒定 4病毒的分子生物學(xué)鑒定 分子生物學(xué)診斷的特異性取決于核酸序列的特異性，病毒的分子生物學(xué)鑒定，包括對(duì)病毒核酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定。 核酸

9、測(cè)定主要使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、探針技術(shù)和核酸序列測(cè)定，檢測(cè)病毒基因組中的特征性區(qū)段甚至整個(gè)病毒基因組；而蛋白質(zhì)測(cè)定可使用免疫測(cè)定技術(shù)、電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)病毒特異的蛋白質(zhì)成分。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚以及體外培養(yǎng)的器官和細(xì)胞都可以作為人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培養(yǎng)，又是病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究以及制備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。 1組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要求比較嚴(yán)格，要用硫酸和重酪酸鉀溶液浸泡后再清洗應(yīng)用。 常用的人工綜合營(yíng)養(yǎng)液為MEM和RPMI1640。用人工綜合營(yíng)養(yǎng)液配制細(xì)胞生長(zhǎng)液時(shí)需要加入適量血清和谷氨酰胺溶液，還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細(xì)菌污染，加人碳酸氫鈉溶液修正pH，

10、根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長(zhǎng)液具有較強(qiáng)的pH緩沖能力。能使組織和成片細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞的化學(xué)制劑為胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可稱(chēng)之為Versen溶液，其分散細(xì)胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細(xì)胞分散。動(dòng)物血清中具有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的各種營(yíng)養(yǎng)因子，它能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，且有很強(qiáng)的酸堿緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可分為細(xì)胞生長(zhǎng)液和細(xì)胞維持液兩種。生長(zhǎng)液是使細(xì)胞發(fā)育增殖的液體，因此要求營(yíng)養(yǎng)條件豐厚；維持液用于延緩細(xì)胞代謝，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，以利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血清含量不同。細(xì)胞生長(zhǎng)適宜的pH范圍是pH7.27.6。細(xì)胞培養(yǎng)技

11、術(shù)全過(guò)程的關(guān)鍵是防止污染。2細(xì)胞株的保存 二甲基亞砜是細(xì)胞低溫保存的良好的保護(hù)劑，含10二甲基亞砜的血清可以作為懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)胞。 3. 病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類(lèi)型可分為原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞三大類(lèi)，原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細(xì)胞是否能在體外無(wú)限傳代。 4. 細(xì)胞的純化 細(xì)胞的純化可以用細(xì)胞克隆技術(shù)。克隆是指用無(wú)性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細(xì)胞和生物群體的過(guò)程。 分子雜交，常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時(shí)多選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 （1）Southern雜交 被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。 （2）Northern雜交 被檢對(duì)象為RNA，探針為D

12、NA或RNA。 PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、 引物 引物是PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的

13、嘌呤或嘧啶核苷酸 的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子 克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。 引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。 2、 酶 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種

14、為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。 3、 dNTP dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L， 4、模板 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋

15、白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。5、Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚

16、合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少?；蛐酒卜Q(chēng)為基因微陣列技術(shù)，指采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的靶基因或寡核苷酸片段固化于支持物表面上，產(chǎn)生探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)監(jiān)測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品進(jìn)行快速、并行、高效檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。基因微陣列技術(shù)主要包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品的準(zhǔn)備和標(biāo)記、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析處理。雖然基因芯片技術(shù)在微生物診斷中存在一定的不足，但還存在很大的應(yīng)用前景，其在微生物診斷中，具有以下優(yōu)越性：1）高通量，可以同時(shí)對(duì)多種微生物進(jìn)行監(jiān)控。2）多條探針的分子雜交，可以有效的克服PCR易被污染的特點(diǎn)，從而提高了特異性。3）可以克服窗

17、口期漏檢情況的發(fā)生。特別是將其應(yīng)用于對(duì)幾種微生物的多重感染的診斷上，和鑒定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鑒定中發(fā)揮了很大的作用。 一、DNA的復(fù)制和修復(fù) 細(xì)胞每分裂一次，染色體DNA就合成一次。DNA分子拆開(kāi)成兩條鏈，每一條單鏈按照堿基配對(duì)的原則合成另一條新單鏈，成為半保留復(fù)制。在體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)必須有RNA引物。 二、轉(zhuǎn)錄 在生物體內(nèi)，DNA指導(dǎo)的RNA合成過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄。它是按照儲(chǔ)存在DNA上遺傳信息合成。合成RNA時(shí)DNA雙鏈也要解旋，解旋部位稱(chēng)啟動(dòng)子。 三、翻譯 在合成各種不同RNA中，tRNA具有搬運(yùn)氨基酸功能。構(gòu)成核糖體骨架的是rRNA，而mRNA直接決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。4種核苷

18、酸排列組成遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時(shí)轉(zhuǎn)換成20種氨基酸的排列順序，遺傳信息的這種轉(zhuǎn)換稱(chēng)為翻譯。3個(gè)核苷酸排列順序代表一種氨基酸密碼，表示蛋白質(zhì)合成開(kāi)始的密碼有一種，DNA三個(gè)終止密碼子分別是UAA、UAG、UGA。在細(xì)菌里，依靠rRNA和mRNA之間一段互補(bǔ)序列能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成開(kāi)始的位置。原核生物核糖體是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA組成。在真核生物核糖體的五種主要的組蛋白中，H1在進(jìn)化中最不保守。限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類(lèi)，其中類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶在分子克隆和微生物鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。絕大多

19、數(shù)類(lèi)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4或6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱(chēng)特異核苷酸序列。DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶切割后產(chǎn)生許多一定長(zhǎng)度的片段，使用電泳的方法分離不同長(zhǎng)度的片段，一種DNA結(jié)構(gòu)就能形成一種特征性的圖形，稱(chēng)為DNA的電泳圖譜。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。 聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5500bp）效果較好，其分辨力極高，甚至相差lbp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠通常采用垂直裝置進(jìn)行電泳。 電泳完畢后，使用溴化乙啶染色，DNA片段聚集的地方，在紫外光下可以顯示發(fā)橙色熒光的條帶。如果電

20、泳中使用了已知大小的DNA片段作為分子量標(biāo)志，可以測(cè)量并計(jì)算出每一DNA片段的長(zhǎng)度。結(jié)合使用多種限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)綜合分析將這些片段排列起來(lái)，便可作出DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜。 DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜又稱(chēng)DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。 分子生物學(xué)基本技術(shù)知識(shí)點(diǎn)質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒

21、的存在使宿主具有一些額外的特性，如致病的能力和對(duì)抗生素的抗性等。 細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。 從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。 抗體檢測(cè)知識(shí)點(diǎn)抗體檢測(cè)方法 （1） 中和反應(yīng) 中和反應(yīng)不僅測(cè)定抗體是否存在，而且測(cè)定抗體是否具有免疫保護(hù)作用，因而，盡管這種方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，影響因素眾多而且不穩(wěn)定，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是病毒性疾病中，仍然是不可取代的抗體檢測(cè)方法。 中和試驗(yàn)的基本方法是，將待檢物質(zhì)與活的致病微生物混合，感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，然后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)病、死亡，或細(xì)胞是否發(fā)生病變。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當(dāng)注意，細(xì)

22、胞的中和試驗(yàn)通常只反應(yīng)抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力，這只是病毒致病過(guò)程中的一小部分。 （2） 沉淀反應(yīng) 血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類(lèi)反應(yīng)稱(chēng)為沉淀反應(yīng)。該類(lèi)反應(yīng)可檢測(cè)到202mgml水平的抗體。較常用的檢測(cè)方法有：1.單向免疫擴(kuò)散 將一定量已知抗原混于瓊脂中制成瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗體加入孔中擴(kuò)散，抗原抗體在擴(kuò)散過(guò)程中形成以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測(cè)血清中的IgG、IgM、IgA和補(bǔ)體C3等的含量。 2雙向免疫擴(kuò)散 將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中，二者自由向四周擴(kuò)散，在相遇處形成沉淀線?？捎糜诳贵w的定性、定量檢測(cè)。 （三）凝集反應(yīng) 細(xì)菌、紅

23、細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，這一類(lèi)反應(yīng)稱(chēng)為凝集反應(yīng)。 1直接凝集 將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。檢測(cè)方法有兩種：一是玻片凝集試驗(yàn)，用于定性測(cè)抗原，多用于快速診斷；二是試管凝集試驗(yàn)，在試管種系列稀釋待檢血清，加入已知顆?？乖ㄋ谰蚧罹?，多用死菌），進(jìn)行的血清反應(yīng)，用于定量檢測(cè)抗體。溫箱中放24小時(shí)后取出反應(yīng)管在室溫放2個(gè)小時(shí)再判斷為宜，判定凝集滴度以凝集程度為+而定。 2間接凝集 將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表明，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。（四）補(bǔ)體參加的反應(yīng) 利用抗體與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，

24、用溶血現(xiàn)象作為指示系統(tǒng)幫助結(jié)果判定。常用的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和溶血空斑試驗(yàn)。（五）用標(biāo)記抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 利用熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點(diǎn)。 1免疫熒光 將已知細(xì)菌、感染病毒的細(xì)胞等顆?？乖裙潭ㄓ谳d玻片，加待檢血清反應(yīng)后，再 加熒光素標(biāo)記的抗抗體，置熒光顯微鏡下觀察判定，用于檢測(cè)抗體。 2 酶免疫測(cè)定 是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)?？捎媚繙y(cè)定性，也可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光 密度（OD）值以反應(yīng)抗體的含量，敏感度可達(dá)ngml甚至pgml。常用于標(biāo)記的酶有辣 根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。常用的方法有酶聯(lián)免疫

25、吸附試驗(yàn)（EUSA）。采用雙抗體 夾心法或間接法檢測(cè)特異抗體。 3 放射免疫測(cè)定法 用放射性的核素（125I和131I）標(biāo)記抗原，檢測(cè)抗體，靈敏度達(dá)pgml。 4 免疫印跡法 將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移置NC或PVDF等膜 上。檢測(cè)特異的抗體。用該法檢測(cè)血清HIV抗體為診斷HIV感染的方法之一。 細(xì)胞免疫檢驗(yàn)知識(shí)點(diǎn)淋巴細(xì)胞的分離與類(lèi)型鑒定 體外檢測(cè)淋巴細(xì)胞，需要先制備外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMc），制備PBMC常用的方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。以下方法通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的某些表面標(biāo)志，可確定細(xì)胞的不同類(lèi)型。 1免疫熒光法 2磁珠分離法 3陶選法

26、 4流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞免疫檢驗(yàn)知識(shí)點(diǎn)免疫細(xì)胞功能測(cè)定 （1） T細(xì)胞功能測(cè)定 1T細(xì)胞增殖試驗(yàn) 2細(xì)胞毒試驗(yàn) （1）51Cr釋放法 （2）乳酸脫氫酶釋放法（3）皮膚試驗(yàn)：根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度檢測(cè)。常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素等。 （二）B細(xì)胞功能測(cè)定 1B細(xì)胞增殖試驗(yàn) B細(xì)胞受絲裂原刺激后，進(jìn)行分裂增殖，溫育一定時(shí)間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。 2抗體形成細(xì)胞測(cè)定 常用的溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定。將SRBC、待檢B細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育l3小時(shí)后，肉眼觀測(cè)分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑的數(shù)量即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。

27、常用儀器知識(shí)點(diǎn)生物培養(yǎng)類(lèi) 1 普通培養(yǎng)箱 分為隔水式和直熱式兩種，隔水式培養(yǎng)箱采用浸入式電熱管隔水加溫，箱內(nèi)各部溫度恒定均勻，為實(shí)驗(yàn)室首選；直熱式培養(yǎng)箱是以電爐絲直接加熱，箱內(nèi)上下層溫度相差較大，指示用溫度計(jì)不能真實(shí)指示底層溫度。 用途：用于普通需氧和兼性厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)。當(dāng)室溫低時(shí)，也可用于真菌培養(yǎng)。但細(xì)菌和真菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時(shí)注意事項(xiàng)：（1） 箱體必須有效接地，避免將水濺在內(nèi)層玻璃門(mén)上，以防玻璃受驟冷而爆裂。 （2） 隔水式培養(yǎng)箱在通電前，一定要先加水（以蒸餾水或去離子水為宜），否則會(huì)燒壞電熱管，經(jīng)常觀察水位指示浮標(biāo)，水位不足時(shí)，及時(shí)補(bǔ)足水量。 （3） 箱內(nèi)的培養(yǎng)物不宜放置過(guò)擠

28、以利冷熱空氣對(duì)流不受阻塞，保持箱內(nèi)溫度均勻。培養(yǎng)時(shí)，打開(kāi)箱體頂部的通風(fēng)口，避免箱內(nèi)濕度過(guò)大。 （4） 如箱內(nèi)溫度不穩(wěn)定，可檢查溫度控制器的接點(diǎn)或請(qǐng)專(zhuān)人檢修。 （5）使用時(shí)應(yīng)早晚觀測(cè)箱內(nèi)溫度各一次，每次觀測(cè)后記錄箱內(nèi)實(shí)際溫度。 （5） 培養(yǎng)箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影響檢測(cè)結(jié)果。 2真菌培養(yǎng)箱 是氣溫過(guò)高地區(qū)培養(yǎng)霉菌和酵母菌的必備設(shè)備。配有加熱、制冷、加濕、消毒系統(tǒng)，可自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度，控制濕度、定時(shí)消毒、自動(dòng)換氣等。當(dāng)室溫高于35時(shí)，也可用于培養(yǎng)細(xì)菌。但真菌和細(xì)菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 使用時(shí)注意事項(xiàng)：（1） 接通電源后，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，設(shè)定溫度，并用測(cè)量開(kāi)關(guān)測(cè)量箱內(nèi)實(shí)際溫度。 （2） 開(kāi)機(jī)一

29、段時(shí)間后加熱和制冷兩燈均不亮，表示箱內(nèi)溫度達(dá)到平衡；如兩燈同時(shí)亮，表示機(jī)器故障，須請(qǐng)專(zhuān)業(yè)人員檢修。 （3） 在箱內(nèi)取放物品時(shí)，切勿碰撞探頭，以免影響靈敏度。 （4） 在制冷裝置啟動(dòng)時(shí)，如有異常聲音，應(yīng)立即停機(jī)檢修。 （5） 儀器使用時(shí)應(yīng)每天兩次（早、晚各一次）觀測(cè)記錄箱內(nèi)實(shí)際溫度，并由使用人和保管人簽字。 （6） 每批培養(yǎng)物培養(yǎng)后，要定期對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行消毒，以免交叉污染。 3.恒溫振蕩培養(yǎng)箱 需恒溫振蕩培養(yǎng)的微生物可用此培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其內(nèi)部有冷、熱氣流風(fēng)道使箱內(nèi)氣體循環(huán)流暢，溫度比較均勻。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)需要選擇相應(yīng)溫度范圍和振蕩頻率的培養(yǎng)箱使用。使用時(shí)注意事項(xiàng)：（1）設(shè)備要求工作地面平整且后部有散

30、熱空間，切勿沖擊散熱片。（2）設(shè)備移動(dòng)時(shí)要平行移動(dòng)，任一方向不可傾斜大于45度。 （3）搖盤(pán)上的螺釘要經(jīng)常檢查，以免所夾物品脫落。 （4）如長(zhǎng)期工作在“制冷”狀態(tài)時(shí)或停機(jī)三個(gè)月以上，要按期做加熱驅(qū)潮處理，每隔兩周一次。 （5）使用中定時(shí)觀測(cè)箱內(nèi)溫度和轉(zhuǎn)速，并做記錄。 （6）如發(fā)生故障，應(yīng)由專(zhuān)業(yè)人員檢修。 4厭氧（CO2）培養(yǎng)箱 主要用于厭氧菌、微需氧菌等的培養(yǎng)。一般由控溫、抽空、細(xì)菌過(guò)濾、細(xì)菌培養(yǎng)罐以及箱外的各種壓縮氣體鋼瓶組成。 使用時(shí)注意事項(xiàng)： （1）N2、CO2鋼瓶可立于箱體旁與箱體相連，H2鋼瓶應(yīng)另置安全處，以免發(fā)生危險(xiǎn)，用時(shí)用橡皮袋取出少許，與上述鋼瓶配用。 （2）作厭氧培養(yǎng)時(shí)，打開(kāi)

31、培養(yǎng)罐門(mén)，將已接種好的培養(yǎng)物放人罐內(nèi)并迅速放人催化劑鈀粒、干燥劑、亞甲基藍(lán)指示劑，關(guān)閉罐門(mén)并扭緊。 （3）打開(kāi)此罐的電磁閥開(kāi)關(guān)和真空泵開(kāi)關(guān)，抽氣至真空度達(dá)到93.3kPa時(shí)，關(guān)閉 真空泵開(kāi)關(guān)。 （4）開(kāi)啟N2輸氣閥，慢慢開(kāi)啟N2鋼瓶和減壓閥，使罐內(nèi)充滿N2氣，關(guān)閉N2氣，開(kāi)啟真空泵抽氣，然后再用N2充氣一次。 （5）第三次按N2 80、H2 10、C0210充氣。待指針回至零位時(shí)關(guān)閉輸氣閥，再關(guān)減壓閥和電磁閥。不可出現(xiàn)負(fù)壓，影響厭氧環(huán)境。 （6）選擇所需溫度，進(jìn)行培養(yǎng)。 （7）在培養(yǎng)過(guò)程中不可打開(kāi)培養(yǎng)罐門(mén)。以免破壞厭氧環(huán)境。 （8）使用過(guò)程中要經(jīng)常觀測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，并進(jìn)行記錄。 常用儀器知識(shí)點(diǎn)

32、顯微成像類(lèi) 1.顯微鏡可分為普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)觀測(cè)項(xiàng)目不同選擇相應(yīng)的類(lèi)型。利用光的衍射作用，以可見(jiàn)光為照明光源的普通光學(xué)顯微鏡的分辨極限為200nm，可觀測(cè)細(xì)菌和細(xì)胞，但對(duì)于細(xì)菌和細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)以及病毒，光鏡無(wú)法辨認(rèn)；電鏡以電子束為照明光源，其波長(zhǎng)極短，可有效提高其分辨率，達(dá)到0.2nm，用電磁透鏡代替玻璃透鏡。 2 暗視野顯微鏡 可分辨0.04微米的物體，微生物實(shí)驗(yàn)室多用于觀察未染色標(biāo)本活的細(xì)菌、真菌等，并可觀察活細(xì)胞內(nèi)的線粒體及細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)。但其只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能看清其細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 載玻片厚度為1.0mm，且載玻片和蓋玻片需清潔無(wú)劃痕；標(biāo)本濃度不宜過(guò)濃。 3

33、 熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是利用熒光光源（紫外光）作為激發(fā)光，透過(guò)經(jīng)熒光色素染色的標(biāo)本，輻射出比激發(fā)光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大后，可觀察其可見(jiàn)的熒光圖像，可分辨標(biāo)本內(nèi)一些物質(zhì)的性質(zhì)與位置。 常用儀器知識(shí)點(diǎn)滅菌、消毒類(lèi)濾菌器是利用微孔濾膜的微小孔徑通過(guò)抽濾或壓濾，將微生物阻留在濾膜上，以便進(jìn)一步培養(yǎng)分析。從材質(zhì)的不同可分為玻璃濾菌器和金屬濾菌器等；從工作原理的不同可分為負(fù)壓抽濾和正壓壓濾。1 超凈工作臺(tái) 超凈工作臺(tái)是微生物實(shí)驗(yàn)室通常使用的無(wú)菌操作臺(tái)，比一般的無(wú)菌操作室更潔凈其潔凈度可達(dá)百級(jí)。 超凈工作臺(tái)采用層流技術(shù)凈化空氣，分為水平式和垂直式，在層流有效區(qū)內(nèi)保持無(wú)菌環(huán)境。但不能保證微生物不

34、污染環(huán)境和操作人員。而另加一套空氣回收系統(tǒng)的生物安全凈化工作臺(tái)，可避免被檢材料污染環(huán)境和操作人員。2 生物安全柜 生物安全柜可提供樣品和工作人員的雙重保護(hù)。過(guò)濾后的潔凈氣流從安全柜頂部吹下，通過(guò)工作區(qū)域，在到工作人員的呼吸區(qū)域前被俘獲。氣流在放空前將被過(guò)濾,一般情況下過(guò)濾后的空氣將被排回實(shí)驗(yàn)室。超凈工作臺(tái)提供的是對(duì)樣品的保護(hù)，對(duì)操作者和環(huán)境是不提供保護(hù)的；而生物安全柜同時(shí)提供對(duì)操作者、環(huán)境和樣品的保護(hù)。 生物安全柜可分為一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)三大類(lèi)以滿足不同的生物研究和防疫要求。 （1）一級(jí)生物安全柜可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品。氣流原理和實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過(guò)濾器

35、。所有類(lèi)型的生物安全柜都在排氣和進(jìn)氣口使用HEPA過(guò)濾器。一級(jí)生物安全柜本身無(wú)風(fēng)機(jī)，依賴(lài)外接通風(fēng)管中的風(fēng)機(jī)帶動(dòng)氣流，由于不能保護(hù)柜內(nèi)樣品，目前已較少使用。 （2）二級(jí)生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛的柜型。按照NSF49的中的規(guī)定，二級(jí)生物安全柜依照人口氣流風(fēng)速、排氣方式和循環(huán)方式可分為4個(gè)級(jí)別：A1，A2，B1，B2。所有的二級(jí)生物安全柜都可提供工作人員、環(huán)境和樣品的保護(hù)。 （3）三級(jí)生物安全柜是為4級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)而設(shè)計(jì)的，柜體完全氣密，工作人員通過(guò)連接在柜體的手套進(jìn)行操作，俗稱(chēng)手套箱，試驗(yàn)品通過(guò)雙門(mén)的傳遞箱進(jìn)出安全柜以確保不受污染，適用于高風(fēng)險(xiǎn)的生物試驗(yàn)。生物安全柜柜內(nèi)操作主要注意事項(xiàng)：

36、 A.緩慢移動(dòng)原則：為了避免影響正常的風(fēng)路狀態(tài)，柜內(nèi)操作時(shí)手應(yīng)該盡量平緩移動(dòng)。 B.物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現(xiàn)象產(chǎn)生，在柜內(nèi)擺放的物品應(yīng)該盡量呈橫向一字?jǐn)[開(kāi)，避免回風(fēng)過(guò)程中造成交叉污染。同時(shí)避免堵塞背部回風(fēng)隔柵影響正常風(fēng)路。 C.避免震動(dòng)原則：柜內(nèi)盡量避免震動(dòng)儀器（例如離心機(jī)漩渦振蕩器等）的使用，因?yàn)檎饎?dòng)會(huì)使得積留在濾膜上的顆粒物質(zhì)抖落。導(dǎo)致操作室內(nèi)部潔凈度降低，同時(shí)如果在前操作面平衡失敗還會(huì)引起安全柜對(duì)操作者的污染。 D.不同樣品柜內(nèi)移動(dòng)原則：柜內(nèi)兩種及以上物品需要移動(dòng)時(shí)，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移動(dòng)原則，避免污染性高的物品在移動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生對(duì)柜體內(nèi)部的大面

37、積污染。E.明火使用原則：柜內(nèi)盡量不要使用明火!因?yàn)樵诿骰鹗褂眠^(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)小顆粒雜質(zhì)將被帶入濾膜區(qū)域，這些高溫雜質(zhì)會(huì)損傷濾膜。無(wú)法避免一定需要使用的時(shí)候，宜使用低火苗的本生燈。 F、需定時(shí)檢測(cè)工作臺(tái)性能，并記錄檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整過(guò)濾器。 G、該設(shè)備應(yīng)有專(zhuān)人保管并記錄使用和檢修情況。 消毒知識(shí)點(diǎn)干熱滅菌法 干熱的殺菌作用是通過(guò)脫水干燥和大分子變性。一般細(xì)菌繁殖體，在干燥狀態(tài)下80100經(jīng)1小時(shí)可被殺死；芽孢則需160170，2小時(shí)才能殺滅。干熱滅菌機(jī)制如下：使菌體蛋白質(zhì)變性；電解質(zhì)濃縮引起中毒。干熱滅菌法包括： （1）焚燒法：用火焚燒，是一種徹底的滅菌方法，僅適用于廢棄的污染物品和有傳

38、染性的動(dòng)物尸體等。 （2）燒灼法：微生物操作用器材可在火焰上燒灼滅菌，但在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中已不主張使用。 （3）干烤法：需在干烤箱內(nèi)進(jìn)行，通電后利用高熱空氣進(jìn)行滅菌。一般加熱160170，維持2小時(shí)即可殺滅包括芽孢在內(nèi)的一切微生物。本法滅菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器等。 （4）紅外線：產(chǎn)生熱效應(yīng)，但只能照到物體的表面，多用于醫(yī)療器械的滅菌。 消毒知識(shí)點(diǎn)濕熱滅菌法 濕熱滅菌法是最常用的滅菌法，效果較好。在同一溫度下濕熱殺菌效果優(yōu)于干熱，其原因有三：濕熱中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固。試驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)含水量增加，凝固所需的溫度降低；濕熱比干熱的穿透力好，這主要是由于水或蒸汽傳導(dǎo)熱能

39、的效率明顯高于空氣；蒸汽有潛熱存在。每一克水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出529卡的熱量。這種潛熱能迅速提高被滅菌物質(zhì)的溫度。 濕熱殺菌機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，主要有以下幾點(diǎn)：使菌體蛋白質(zhì)變性和凝固；使細(xì)菌核酸降解；使細(xì)菌胞漿膜損傷。常用的濕熱殺菌法有： （1）煮沸法：煮沸1005分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，但一般消毒以煮沸10分鐘為宜，殺死芽孢則需煮沸13小時(shí)。煮沸法主要用于一般外科器械、注射器、膠管和食具等的消毒。若水中加入l2碳酸氫鈉，可提高沸點(diǎn)105，既可增強(qiáng)殺菌能力，又可防止金屬器械生銹。 （2）流動(dòng)蒸汽滅菌法：又稱(chēng)常壓蒸汽消毒法，是利用一個(gè)大氣壓下100的水蒸汽進(jìn)行消毒，加熱1530分鐘可殺死

40、細(xì)菌的繁殖體，但不保證殺死芽孢。 （3）間歇蒸汽滅菌法：是利用反復(fù)多次的流通蒸汽殺死細(xì)菌所有繁殖體和芽孢的一種滅菌法。本法適用于耐熱物品，也適用于不耐熱的含糖、牛奶等培養(yǎng)基。 （4）高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌法，滅菌的溫度取決于蒸汽的壓力。在一個(gè)大氣壓下，蒸汽的溫度是100。如果蒸汽被限制在密閉的容器里，隨著壓力的升高，蒸汽的溫度也相應(yīng)的升高。在103.4kPa(1.05kgcm2)蒸汽壓力下，溫度達(dá)到121.3，維持1520分鐘，可殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有的微生物。此法適用于高溫和不怕潮濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、注射器、手術(shù)衣、敷料和橡皮手套等

41、耐高溫、耐濕熱物品的消毒。 （5）巴氏消毒法：常用于牛奶和酒類(lèi)的消毒。此法可殺死物品中的病原菌或一般雜菌，而不嚴(yán)重破壞物品的質(zhì)量。方法有兩種：一種是加熱61.162.830分鐘；另一種是71.7經(jīng)1530秒，現(xiàn)廣泛采用后法。 消毒知識(shí)點(diǎn)其他物理殺菌方法 (一)輻射殺菌法 1紫外線 日曬是一種有效的天然殺菌方法，其殺菌作用主要是靠日光中的紫外線。將病人的被褥、衣服、書(shū)報(bào)等放在日光下暴曬數(shù)小時(shí)，可達(dá)到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫外線是由低壓水銀蒸汽燈、紫外線燈產(chǎn)生的。由于紫外線穿透力較弱，不能透過(guò)玻璃、紙張等物品，故只適用于空氣和物品表面的消毒。紫外線對(duì)人體皮膚和眼睛角膜有一定的損傷作用，使用

42、紫外線燈照射時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。 紫外線的殺菌作用與其波長(zhǎng)有關(guān)，通常波長(zhǎng)為240280nm者具有殺菌作用。其中以260nm最強(qiáng)。 2電離射線 電離射線具有較高的能量和穿透力，可直接或間接破壞微生物的核酸、蛋白質(zhì)和酶系統(tǒng)，從而對(duì)其產(chǎn)生致死效應(yīng)。用于消毒滅菌的電離射線有X射線 (二)濾過(guò)除菌法 濾過(guò)除菌是用特殊的器具將液體或空氣中細(xì)菌除去的方法。所用器具是含有微細(xì)小孔的濾菌器，通常大于孔徑的細(xì)菌不能通過(guò)，借以獲得無(wú)菌液體或空氣。主要用于不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素、藥液和空氣等的除菌，除菌濾器一般不能除去病毒、支原體和L型細(xì)菌。 濾菌器的種類(lèi)很多，目前常用的有蔡氏濾菌器、玻璃濾菌器、薄膜濾菌器。 (

43、三)超聲波殺菌法 超聲波可以裂解多數(shù)的細(xì)菌，尤其是革蘭陰性菌更為敏感，但往往有殘存者。目前，超聲波主要用于粉碎細(xì)胞，以提取細(xì)胞組份或制備抗原等。超聲波裂解細(xì)菌的機(jī)制主要是它通過(guò)水時(shí)發(fā)生的空(腔)化作用，在液體中造成壓力改變。 (四)干燥與低溫抑菌法 有些細(xì)菌的繁殖體在空氣中干燥時(shí)會(huì)很快死亡，例如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍亂弧菌等，但有些細(xì)菌的抗干燥力較強(qiáng)，如溶血性鏈球菌在塵埃中存活可達(dá)25天，結(jié)核分枝桿菌在干燥的痰中可數(shù)月不死。芽胞的抵抗力更強(qiáng)，炭疽芽胞桿菌的芽胞耐干燥可達(dá)20多年。干燥法常用于保存食物，濃鹽或糖漬食品可使細(xì)菌體內(nèi)水分散失，造成生理性的干燥，細(xì)菌的生命活動(dòng)停止，防止食物變質(zhì)。

44、 低溫可使細(xì)菌的新陳代謝減慢，常用做保存細(xì)菌菌種，當(dāng)溫度回升至適宜范圍的時(shí)候，又能恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖。為避免解凍時(shí)對(duì)細(xì)菌的損傷，可在低溫狀態(tài)下真空抽去水分，此法稱(chēng)為冷凍真空干燥法。消毒知識(shí)點(diǎn)化學(xué)消毒法 化學(xué)消毒法是利用化學(xué)藥物殺死或抑制病原微生物的方法。具有殺菌作用的化學(xué)藥品稱(chēng)化學(xué)消毒劑；用于抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的化學(xué)藥品稱(chēng)防腐劑?；瘜W(xué)消毒劑不僅對(duì)細(xì)菌有毒害作用，對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用。因此，只能外用或用于環(huán)境的消毒。 根據(jù)化學(xué)消毒劑的殺菌機(jī)制的不同，主要分為以下幾類(lèi)： (1) 促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，例如酚類(lèi)(高濃度)、醇類(lèi)、重金屬鹽類(lèi)(高濃度)、酸堿類(lèi)、醛類(lèi)； (2) 干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝

45、，例如某些氧化劑、重金屬鹽類(lèi)(低濃度)與細(xì)菌的-SH基結(jié)合使有關(guān)酶失去活性； (3) 損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜，例如酚類(lèi)(低濃度)、表面活性劑、脂溶劑等，能降低細(xì)菌表面張力并增加其通透性，胞外液體內(nèi)滲，致使細(xì)菌破裂。 酚類(lèi)：石炭酸、來(lái)蘇、洗比泰等酚類(lèi)化合物，低濃度時(shí)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使胞內(nèi)容物漏出；高濃度時(shí)是菌體蛋白質(zhì)凝固。 醇類(lèi)：殺菌機(jī)制在于去除細(xì)菌胞膜中的脂類(lèi)，并是菌體蛋白質(zhì)變性。乙醇最常用，濃度7075%時(shí)殺菌力最強(qiáng)，高濃度因能使菌體表面蛋白質(zhì)迅速凝固，殺菌力反而降低。 重金屬鹽類(lèi)：高濃度時(shí)與帶陰性電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合，使之發(fā)生變性或沉淀，也可以與細(xì)菌酶蛋白的-SH基結(jié)合，使其喪失酶活性。 氧化劑

46、：常用的有過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸、高錳酸鉀與鹵素等。殺菌機(jī)制依靠其氧化能力。過(guò)氧乙酸為強(qiáng)氧化劑，對(duì)細(xì)菌的繁殖體和芽胞、真菌、病毒等都具有殺滅作用，應(yīng)用廣泛，但易分解并具有刺激性和腐蝕性，不適用于金屬器具的消毒。用于消毒的鹵素有碘和氯兩類(lèi)，碘多用于皮膚的消毒，氯多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。 表面活性劑：常用于消毒的表面活性劑有新潔爾滅。 烷化劑：殺菌機(jī)制在于對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用，殺菌譜廣，殺菌力強(qiáng)。常用的有甲醛、環(huán)氧乙烷和戊二醛等。缺點(diǎn)是有些對(duì)人體有毒性，并且有些烷化劑可能有致癌作用。 消毒知識(shí)點(diǎn)影響消毒滅菌的效果因素 1 消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間 消毒劑在一

47、定濃度下，對(duì)細(xì)菌的作用時(shí)間越長(zhǎng)，消毒效果越好。 2 微生物的種類(lèi)與數(shù)量 同一消毒劑對(duì)不同微生物的殺菌效果不同，一般的消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用要比其他細(xì)菌繁殖體作用差；70乙醇能殺死一般細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅細(xì)菌的芽胞，必需根據(jù)消毒對(duì)象選擇合適的消毒劑。此外，微生物的數(shù)量越大，所需要的消毒的時(shí)間就越長(zhǎng)。 3 溫度 溫度升高可以提高消毒效果。 4 酸堿度 消毒劑的殺菌作用受酸堿度的影響，例如戊二醛本省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有殺滅芽胞的作用。 5 有機(jī)物 環(huán)境中有機(jī)物的存在可影響消毒的效果。 細(xì)菌檢驗(yàn)基本技術(shù)：芽胞染色、莢膜染色及鞭毛染色 1 芽胞染色 用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠在加熱條件下

48、染色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可以進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而進(jìn)入芽胞一經(jīng)著色則很難被水洗脫色。當(dāng)用復(fù)染劑染色后，芽胞仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽胞囊被染成復(fù)染劑的顏色，使芽胞和菌體更容易區(qū)分。 芽胞染色的操作步驟： 制成菌懸液孔雀綠染色分鐘將試管水浴加熱分鐘一用接種環(huán)取加熱染色菌液制成涂片干燥固定水洗脫色蕃紅花或稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染分鐘水洗晾干油鏡觀察。 2 莢膜染色 由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周?chē)室煌该魅?。由于莢膜的含水量在以上，故染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。 在莢膜染色方法中

49、，以負(fù)染色法和濕墨水法較為常用，其中濕墨水法較簡(jiǎn)便，并且適用于各種有莢膜的細(xì)菌。 3 鞭毛染色 細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用鍍銀法染色。在顯微鏡下，主要觀察菌落結(jié)構(gòu)，表面特征和菌落邊緣的形態(tài)等。例如炭疽芽胞桿菌菌落邊緣呈現(xiàn)大量卷曲的纖絲狀紋理，稱(chēng)為獅鬃樣菌落；鼠疫菌落表面呈現(xiàn)粗糙的顆粒狀突起，在血瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落邊緣帶有“花邊”；支原體的菌落呈現(xiàn)“荷包蛋”狀等。生活飲用水水質(zhì)微生物檢測(cè)樣品采

50、集及處理知識(shí)點(diǎn)水樣的采集與保存 1、 水樣的采集 1.對(duì)容器的要求容器及瓶塞、瓶蓋應(yīng)能經(jīng)受滅菌的溫度，并且在這個(gè)溫度下不釋放或產(chǎn)生任何能抑制生物活動(dòng)或?qū)е滤劳龌虼龠M(jìn)生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。玻璃或聚丙烯塑料容器用自來(lái)水和洗滌劑洗滌，然后用自來(lái)水徹底沖洗。用硝酸溶液（1+1）浸泡，再用自來(lái)水，蒸餾水洗凈。 為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原余氯每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉（100gL）。 2容器滅菌熱力滅菌是最可靠而普遍應(yīng)用的方法。熱力滅菌分干熱和高壓蒸汽滅菌兩類(lèi)。聚丙烯瓶只能用高壓蒸汽滅菌，玻璃瓶可用兩種方法滅菌。干熱滅菌之后，玻璃容器是干燥的，便于保存和應(yīng)用；高壓蒸汽滅菌之后

51、，應(yīng)自滅菌器中取出放在烤箱內(nèi)烤干，干熱滅菌所需溫度較高、時(shí)間較長(zhǎng)。高壓蒸汽滅菌法要求12115分鐘，即可殺死芽胞。干熱滅菌法殺死芽胞需160180、維持2小時(shí)。 3為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原余氯每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉（100gL）。 4采集自來(lái)水時(shí)應(yīng)開(kāi)啟水龍頭，適當(dāng)放水?dāng)?shù)分鐘后再取樣。 二、水樣的保存方法 4保存，4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。 醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識(shí)點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)污泥的采樣和樣品處理所采集的樣品應(yīng)具有代表性，制成約500g的表層和中層的平均混合樣品，置于無(wú)菌容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。污水樣品采集后應(yīng)按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)，如不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將樣品放

52、置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)檢驗(yàn)。（一）檢測(cè)糞大腸菌值時(shí)樣品的采集及處理稱(chēng)取采集的污泥樣品100g，溶解于100ml無(wú)菌生理鹽水中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍脽o(wú)菌吸管吸取此混懸液2ml，加入發(fā)酵管中培養(yǎng)；并將此混懸液依次稀釋后，吸取不同濃度的稀釋液按檢驗(yàn)要求接種發(fā)酵管培養(yǎng)。（二）檢測(cè)沙門(mén)菌和志賀菌時(shí)樣品的采集和處理稱(chēng)取采集的污泥樣品30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入300ml無(wú)菌生理鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹?，制?10混懸液，用無(wú)菌吸管吸取此混懸液100ml加入相應(yīng)增菌液中培養(yǎng)。（三）檢測(cè)結(jié)核桿菌時(shí)樣品的采集和處理稱(chēng)取采集的污泥樣品10g，放入滅菌容器內(nèi)，加入100ml無(wú)菌水沖洗過(guò)濾（濾紙漏斗），再經(jīng)玻璃漏斗G2（

53、孔徑1015pm）和G4（孔徑34pm）抽濾，最后再經(jīng)濾膜（孔徑0.450.7靘）抽濾。取下濾膜，用4硫酸3ml，充分振蕩沖洗30分鐘。取上述酸性溶液各0.1ml，分別接種培養(yǎng)。（四）檢測(cè)蛔蟲(chóng)卵時(shí)樣品的采集和處理采集回的樣品應(yīng)立即檢驗(yàn)，如不能立即檢驗(yàn)應(yīng)加入510ml3或5甲醛或3鹽酸溶液，用平皿蓋住廣口瓶瓶口，然后放于冰箱內(nèi)，以防止微生物繁殖和蛔蟲(chóng)卵的發(fā)育。醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識(shí)點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水的采樣和樣品處理所采集的樣品應(yīng)具有代表性，采集后應(yīng)立即登記，編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)，如不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將樣品放置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)檢驗(yàn)。（一）檢測(cè)總余氯指標(biāo)時(shí)樣品的采集

54、及處理1所檢測(cè)樣品需在醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水最終排放口處用沖洗干凈的玻璃容器采集。2采樣后應(yīng)立即檢測(cè)，避免強(qiáng)光、振蕩及溫?zé)岬纫蛩氐挠绊?。為避免污水中懸浮性固體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，可用離心機(jī)離心分離，棄去懸浮物沉淀。3被測(cè)樣品的溫度應(yīng)在1520。如低于此溫度，應(yīng)先將盛樣品的玻璃容器放人溫水中，使其溫度升至要求溫度后，再測(cè)定數(shù)值。（二）檢測(cè)糞大腸菌群時(shí)樣品的采集及處理1用采水器或其他無(wú)菌容器采取污水樣1000ml，放入滅菌瓶?jī)?nèi)（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5硫代硫酸鈉溶液5ml中和余氯）。2采集好的水樣應(yīng)立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，一般不宜超過(guò)2小時(shí)，否則應(yīng)在10下保存樣品，但需在6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。（三）檢測(cè)沙門(mén)菌和志賀菌時(shí)樣品的采集和處理1用采水器或其他無(wú)菌容器采取污水樣1000ml，放入滅菌瓶?jī)?nèi)（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5硫代硫酸鈉溶液5ml中和余氯）。2采集好的水樣應(yīng)立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，一般不宜超過(guò)2小時(shí)，否則應(yīng)在10下保存樣品，但需在6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。3取污水250ml，用無(wú)菌紗布或脫脂棉進(jìn)行初濾，然后用濾膜進(jìn)行抽濾，將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入相應(yīng)的增菌液中