DNA重組技術(shù)的基本工具課PPT課件

1、.,1,選修3,.,2,你還記得我們嗎？,氫鍵 磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 運(yùn)載體,.,3,.,4,專題1.基因工程的基本內(nèi)容,基因工程的概念,1.1 基因工程的基本工具,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的發(fā)展史,1.3 基因工程的應(yīng)用,1.4 蛋白質(zhì)工程的崛起,.,5,基因工程的概念：,基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。,.,6,別名： 操作環(huán)境： 原

2、理： 操作水平： 結(jié)果：,基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),生物體外,基因重組,DNA分子水平,定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種。,.,7,基因工程的產(chǎn)物,.,8,.,9,這就要用到定向改造生物的新技術(shù) 基因工程,.,10,基因工程的概念,基因工程的發(fā)展史,（自學(xué)了解）,.,11,普通棉花 抗蟲棉,.,12,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：,普

3、通棉花(無抗蟲基因),蘇云金芽孢桿菌,提取,抗蟲基因,與運(yùn)載體DNA拼接 導(dǎo)入,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),轉(zhuǎn)基因棉花植株,上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？,.,13,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,“分子縫合針” DNA連接酶,“分子運(yùn)輸車” 運(yùn)載體,.,14,1、簡(jiǎn)稱： 2、分布：,一、限制性核酸內(nèi)切酶 “分子手術(shù)刀”,主要在原核生物中,限制酶,尋根問底(P4),你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？,.,15,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防

4、御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用,.,16,思考與探究 P7,2、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？,通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。,.,17,以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列 如：GAA TTC CCC GGG

5、 CTT AAG GGG CCC,限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn),.,18,（專一性）,限制酶的識(shí)別特點(diǎn),.,19,3、特點(diǎn):,識(shí)別特定核苷酸列, 切割特定切點(diǎn),（專一性）,4.切點(diǎn)：,磷酸二酯鍵,.,20,.,21,.,22,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,中心軸線兩側(cè)切開,.,23,什么叫黏性末端？,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,.,24,Sma,平末端 平末端,中心軸線處切開,.,25,4、結(jié)果：,產(chǎn)生黏性未端和平末端,.,26,以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ重復(fù)排列 如：GAA TTC CCC

6、GGG CTT AAG GGG CCC,限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn),.,27,3、特點(diǎn):,4、結(jié)果：,1、簡(jiǎn)稱： 2、分布：,一、限制性核酸內(nèi)切酶,主要在原核生物中,限制酶,識(shí)別特定核苷酸列, 切割特定切點(diǎn),（專一性）,產(chǎn)生黏性未端或平末端,.,28,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,思考?,.,29,Go back,GAATTC CTTAAG,GA

7、ATTC CTTAAG,EcoR,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,不同來源的DNA片段混合,將不同種來源的DNA片段連接起來,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,G AATTC CTTAA G,酶切,.,30,1、作用:,把DNA片段拼接成新的DNA，,2、作用原理：,催化磷酸二酯鍵形成,（不是氫鍵）,二、 DNA連接酶 “分子縫合針”,.,31,可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，,即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,.,32,T4DNA連接酶,.,33,3、類型：,EcoliDNA連接酶,T4DNA連接酶,來源,功能,大腸桿菌

8、,T4噬菌體,只能連接黏性末端,能連接黏性末端和 平末端,.,34,尋根問底 (P6),DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,作用 對(duì)象,DNA復(fù)制,基因重租,4、 DNA連接酶與DNA聚合酶比較,.,35,3、類型,E,coli,DNA,連接酶,來源：大腸桿菌,作用特點(diǎn)：只連接黏性末端,T,4,DNA,連接酶,來源：,T,4,噬菌體,作用特點(diǎn)：連接黏性末端和平末端,2、作用原理：,催化磷酸二酯鍵形成,1、作用: ：,二、 DNA連接酶,把DNA片段拼接成新的DNA，,.,36,1、載體必須具備的

9、條件： 能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存； 具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與 外源基因連接 具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。 對(duì)受體細(xì)胞無害,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,.,37,2、常用的載體： 質(zhì)粒， 噬菌體的衍生物， 動(dòng)植物病毒等,.,38,能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制,有切割位點(diǎn),有標(biāo)記基因,3、質(zhì)粒,本質(zhì)：小型環(huán)狀DNA分子。,分布：許多細(xì)菌、 酵母菌等生物,.,39,三、運(yùn)載體,1、質(zhì)粒： 2、需要的條件： 有1多個(gè)限制酶切點(diǎn) 能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制，或整合到受體細(xì)胞的 染色體DNA上復(fù)制 有某些標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 對(duì)受體細(xì)胞無害 3、常用運(yùn)載

10、體： 質(zhì)粒、噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒,.,40,1、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同種限制酶 B. 兩種限制酶 同種連接酶 D. 兩種連接酶,反饋練習(xí)：,.,41,2、不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,.,42,4、下列說法正確的是：（ ） A、限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶、 連接酶、運(yùn)載體 D、利用運(yùn)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因 進(jìn)行大量復(fù)制的過程可稱為“克隆”,審題,.,43,2和7能連接

11、形成ACGT TGCA； 4和8能連接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能連接形成GCGC CGCG； 1和5能連接形成CTGCAG GACGTC。,教材P7思考與探究 1,.,44,1.1944年艾弗里(O.Avery)等進(jìn)行了肺炎雙球菌體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),證明了DNA是生物的遺傳物質(zhì),并且證明了DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體,成為基因工程的先導(dǎo),基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破,.,45,2.1953年沃森和克里克建立了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,使生物學(xué)進(jìn)入分子水平。,1958年梅塞爾松和斯塔爾,以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料,運(yùn)用同位素示蹤技

12、術(shù),用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的復(fù)制是以半保留方式進(jìn)行的.,1957年克里克提出中心法則的確立,.,46,3.1963年尼倫伯格和馬太做蛋白質(zhì)體外合成實(shí)驗(yàn),破譯編碼氨基酸的遺傳密碼.,.,47,1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 2)工具酶的發(fā)現(xiàn) 3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明,技術(shù)發(fā)明命使基因工程的實(shí)施成為可能,1967年羅思和赫林斯基發(fā)現(xiàn)細(xì)菌質(zhì)粒有自我復(fù)制能力,為基因轉(zhuǎn)移找到一種運(yùn)載工具.,1970年阿爾伯(W.Arber)、內(nèi)森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制酶,1977年科學(xué)家又發(fā)明了DNA序列分析方法,1965年桑格發(fā)明了氨基酸序列分析技術(shù),.,48,4) DNA體外重組的實(shí)現(xiàn),1972年伯格(P.Berg)首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究,成功地構(gòu)建了第一個(gè)人工體外重組DNA分子.,.,49,1973年博耶和科恩使重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA,并使外源基因可以在原核細(xì)胞中成功表達(dá),至此表明基因工程正式問世.,1973年科學(xué)家才將質(zhì)粒作為基因的載體使用,這是基因工程發(fā)展史上第一個(gè)成功的基因克隆實(shí)驗(yàn),1973年科恩第一個(gè)建成“基因工程菌”，并創(chuàng)立基因工程模式,1973年稱這“基因工程元年”，,科恩被稱為基因工程發(fā)展史上的創(chuàng)始人,科恩并向美國(guó)申報(bào)了