魏氏梭菌及其主要毒素的研究進(jìn)展

1、魏氏梭菌及其主要毒素的研究進(jìn)展,報告內(nèi)容,魏氏梭菌概述 魏氏梭菌毒素研究,綜述,分型及其依據(jù),魏氏梭菌產(chǎn)生的毒素,四種主要毒素研究進(jìn)展,純化及鑒定,細(xì)菌毒力,綜述,革蘭氏陽性有莢膜不運動的厭氧大桿菌，芽孢橢圓形,位于菌體中央或次極端，芽胞直徑不大于菌體，在一般培養(yǎng)時不易形成芽胞，在無糖培養(yǎng)基中有利于形成芽胞（菌體形態(tài)） 廣泛分布于自然界，同時也是腸道中的常見菌之一，在一定條件下，可引起各種嚴(yán)重疾病 發(fā)病急、死亡快，因此對于本病的防制主要用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防 危害：猝死癥，家禽壞死性腸炎，人食物中毒及氣性壞疽 ；家畜腸毒血癥、壞死性腸炎，痢疾,培養(yǎng)特性,本菌雖屬厭氧性細(xì)菌，但對厭氧程度的要求并不太

2、嚴(yán)，2%10%的CO2條件下，生長更好 在普通培養(yǎng)基上能生長，若加葡萄糖，血液，則生長更好 生長適宜溫度為37-47，多認(rèn)為43-47為最宜溫度，在適宜條件下增代時間僅8min,培養(yǎng)特性,血平板：雙層溶血環(huán) 內(nèi)環(huán)完全溶血-毒素 外環(huán)不完全溶血- 毒素 蛋黃瓊脂平板：Nagler反應(yīng) 庖肉培養(yǎng)基：數(shù)小時即可見到生長，產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵槐幌?牛乳培養(yǎng)基：“洶涌發(fā)酵”（stormy fermentation）,分型及其依據(jù),根據(jù)此菌產(chǎn)生外毒素的種類，可將其分為A、B、C、D和E 5個型 A型菌： B型菌： C型菌： D型菌： E型：,魏氏梭菌與相應(yīng)疾病,其中，A型菌主要引起

3、人的氣性壞疽和食物中毒，也可引起動物的氣性壞疽，牛、綿羊、家兔腸毒血癥 B型菌主要引起羔羊痢疾； C型菌主要是牛、豬腸毒血癥、羊猝狙 D型菌引起羔羊、綿羊、山羊、牛以及灰鼠的腸毒血癥； E型菌可致犢牛、羔羊腸毒血癥，但很少發(fā)生。,分離診斷,純化,液體培養(yǎng)基,65-70C半小時,43溫箱培養(yǎng),3-4小時,連續(xù)傳代,鏡檢,TSC.石蕊牛奶,血平板,侵襲力：病原菌有突破宿主皮膚、黏膜 生理屏障等 免疫防御機(jī)制，進(jìn) 入體內(nèi)定居、繁殖和擴(kuò)散的能 力，包括莢膜、粘附素和侵襲 性物質(zhì)。 毒素：含有損害宿主組織、器官并引起生理功能紊亂的大分子成分。,毒力,細(xì)菌的毒力,莢膜、微莢膜。,黏附素：細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)。

4、 菌毛分泌物 細(xì)菌的表面組分：如磷壁酸。,2、侵襲性物質(zhì)：協(xié)助病菌抗吞噬或向四周擴(kuò)散。如致病性葡萄球菌凝固酶、A群鏈球菌透明質(zhì)酸酶、鏈激酶等從而有利于細(xì)菌在組織中擴(kuò)散。,侵襲力,1、菌體的表面結(jié)構(gòu),細(xì)菌在生長繁殖中產(chǎn)生和釋放的毒性成分，可直接或間接損傷宿主細(xì)胞、組織和器官，干擾其生理功能。 外毒素 內(nèi)毒素,（二）毒素,內(nèi)毒素毒性作用,(A)熱源性,(C)內(nèi)毒素血癥和休克,(D)彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）,(B)白細(xì)胞數(shù)目改變,疫苗現(xiàn)狀,梭菌類的疫苗有單價苗和多聯(lián)苗，單價疫苗在實際應(yīng)用中難以取得很好的效果，原因是致病的梭菌種類較多，而且有的是混合感染，單價苗往往是顧此失彼，不能有效地預(yù)防疾病。

5、國外相繼出現(xiàn)了包括產(chǎn)氣莢膜梭菌的四聯(lián)、五聯(lián)、七聯(lián)和八聯(lián)苗梭菌苗，不僅把梭菌苗聯(lián)合起來，而且還把所梭菌苗與需氧菌苗(如巴氏桿菌苗、沙門氏桿菌苗)聯(lián)合起來，甚至與病毒苗(如羊痘疫苗)聯(lián)合起來進(jìn)行防疫。,疫苗現(xiàn)狀,國內(nèi)首先出現(xiàn)的是羔羊痢疾，腸毒血癥等單價苗，繼之出現(xiàn)了羊猝狙、快疫二聯(lián)苗，羊黑疫、快疫二聯(lián)苗，快疫、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)苗。文希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、腸毒血癥、黑疫五聯(lián)苗。紀(jì)金春等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、腸毒血癥、黑疫和肉毒中毒六聯(lián)苗。,疫苗現(xiàn)狀,上世紀(jì)70年代到80年代，中監(jiān)所的文希喆、王泰健、屠偉英等科研人員，在國際上率先開創(chuàng)了梭菌多聯(lián)干

6、粉苗的研究，取得滿意效果，保存期長，使用方便，可以隨意搭配，疫苗的保護(hù)期也得到的延長，基本克服了液體苗的缺陷。 效力檢驗：多聯(lián)苗所含的成份越多，需要的動物也越多，以致于達(dá)到不便檢驗的程度，嚴(yán)重阻礙了多聯(lián)苗的發(fā)展， 采用免疫動物測定血清中和效價的方法，來評價梭菌苗的效力。其方法是用梭菌苗免疫動物兩次后，用國際單位(I.U.)衡量血清的中和效價，檢驗每批疫苗所需試驗動物為8-12只。,免疫效果與制苗菌液中毒素毒力正相關(guān) 抗原含量過大會產(chǎn)生嚴(yán)重局部反應(yīng)，會導(dǎo)致安全性檢驗不合格,主要毒素,毒素,各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生毒素,它是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒素之一,同時又是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素 是A型產(chǎn)氣

7、莢膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶(Sphin-gomyelinase)兩種酶活性,能水解細(xì)胞膜的主要成分膜磷脂,從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,理化性質(zhì)和生物學(xué)特性,毒素是由370個氨基酸組成的單鏈多肽,分子量為43 ku。它是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶,具有細(xì)胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性 當(dāng)把毒素加熱至6070時,就可以使其失去活性,當(dāng)進(jìn)一步加熱到100時,又可以恢復(fù)部分活性,毒素基因的克隆與表達(dá),毒素基因在禽類和哺乳動物中都是保守的 毒素的啟動子是最強的啟動子之一,可被大腸桿菌的RNA聚合酶所

8、識別,因而毒素在自身啟動子下不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身中高效表達(dá),也可在大腸桿菌中得到高效表達(dá) 免疫毒素的C端功能區(qū),來預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌所致氣性壞疽的發(fā)生 劉家森等克隆了毒素基因序列中從第294個堿基到中止密碼子約900 bp的核苷酸序列,并表達(dá)出大小約3. 8 ku的重組蛋白。重組蛋白完全涵蓋了毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端內(nèi)對毒素起重要作用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸殘基;表達(dá)的重組蛋白含量占到菌體蛋白總量的30%以上,且表現(xiàn)出良好的反應(yīng)原性,無毒性現(xiàn)象產(chǎn)生。,毒素,產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素是由產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和C型菌株產(chǎn)生的壞死、致死性毒素,可引起人和動物

9、的壞死性腸炎, 。 毒素對胰酶敏感，37作用30min后即完全失活 毒素分為1、2毒素,其中2毒素是近年確認(rèn)的由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一種新的毒素。2毒素與1毒素沒有明顯的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物學(xué)活性。而且,抗2毒素的抗體能識別純化的2毒素,并能與1毒素發(fā)生弱反應(yīng),然而,抗1毒素的抗體只能與1毒素反應(yīng),卻不能與2毒素發(fā)生反應(yīng),表明二者的免疫學(xué)相關(guān)性差,但其機(jī)制尚不清楚。,1毒素,1毒素是一種強毒素,具有細(xì)胞毒性、致死性。純化的1毒素分子量為34 ku左右,等電點(PI)約為5. 6。,2毒素,1997年Gibert等首先從來自仔豬壞死性腸炎病例的培養(yǎng)上清中分離純化到這種C型產(chǎn)氣莢

10、膜梭菌(CWC245)毒素 2毒素與家畜的梭菌性胃腸道疾病有關(guān) 2毒素在豬的胃腸道疾病中發(fā)揮了一定作用 2毒素基因存在于質(zhì)粒上 研究剛起步,毒素,毒素是由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生，能引起家畜的致死性腸毒血癥,又稱肉性腎病 毒素的編碼基因etx位于質(zhì)粒上,etx基因編碼的蛋白毒素前體在分泌初期是無毒性的,通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個氨基酸和C端22個氨基酸后成為有活性的成熟肽,成熟肽分子質(zhì)量為32 ku，參與活化的蛋白酶包括產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。 毒素是致死性毒素,給小鼠靜脈注射納克級的毒素,在30 min內(nèi)即可引起小鼠死亡,并且其毒力僅次于肉

11、毒素和破傷風(fēng)毒素,毒素,這種通過切除N、C末端兩段序列且還有菌體自身蛋白參與的活化過程較為少見。Miyata S等證明,去除C末端氨基酸殘基是活化作用的關(guān)鍵,而且不同的酶切產(chǎn)生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最強,而N末端氨基酸殘基去除與否對毒素活性基本沒有影響。惟有C末端的切除位點對毒素活性,包括在神經(jīng)突觸膜上形成七聚體的能力有影響。去除C末端氨基酸殘基后的成熟毒素其毒性是毒素前體的1 000倍。,毒素,毒素與宿主細(xì)胞表面的作用機(jī)制還不是很清楚,但是現(xiàn)已證明它可以識別小鼠腦細(xì)胞和突觸小體膜上的唾液糖蛋白受體。目前只有兩種細(xì)胞系對毒素敏感,分別為MDCK和人成平滑肌瘤G402細(xì)胞據(jù)推測這與這兩種細(xì)胞表面存在有效結(jié)合毒素的受體有關(guān)。,毒素,E型魏氏梭菌分泌 組成 ：酶部分(Ia)和結(jié)合部分(Ib) 功能： （1）Ia是一種ADP核糖轉(zhuǎn)移酶;而Ib是一種細(xì)胞結(jié)合蛋白 。 （2） Ib與細(xì)胞膜的受體結(jié)合后，立即進(jìn)入細(xì)胞膜間隙，形成低聚體，繼而與Ia結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)吞作用。 （3）Ib激活后能形成離子通道，而Ia則在pH值低于5.6時封閉這一通道。,產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE),產(chǎn)生 ：A型魏氏梭菌在芽孢期產(chǎn)生的，部分C、D型菌也可產(chǎn)生。 影響因素：pH、溫度和碳源 功能 （1）小腸上皮細(xì)胞的頂部形成一個小孔，從而造成宿主