免疫分析法ppt課件

1、,生物藥物分析 第三章 免疫分析法,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對機(jī)體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理損傷的機(jī)制，研究有效的免疫措施，實現(xiàn)以防病，治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。,一、概述,什么叫免疫分析？ 基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種技術(shù)手段?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。 在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要

2、用于抗原或抗體的檢測，用于免疫學(xué)診斷。,(1) 在實驗藥物動力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測定生物利用度和藥物代謝動力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況； (2) 在藥物的臨床檢測中，對治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血液濃度進(jìn)行監(jiān)測； (3) 在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測定有效組分的含量，以實現(xiàn)對生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測； (4) 對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評價。,在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：,.,免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來選擇性識別和測定，可以

3、作為抗體或抗原的待測物. 免疫分析方法,.,免疫分析檢測的發(fā)展,放射免疫檢測（興起于20世紀(jì)70年代),酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；,以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)（20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。,可逆性,比例性 反應(yīng)階段性,特異性,免疫分析法的特點(diǎn),特異性,特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性 分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性,可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。 影響因素： 抗體對相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢

4、固，越不易解離 環(huán)境因素對復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度,比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系 前帶(prezone)：抗體過量 后帶(postzone)：抗原過量 等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,.,2.1 定義,抗原（antigen）：指在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)。 免疫原性（immunogenicity）：被注射入動物體內(nèi)后，使其產(chǎn)生循環(huán)抗體或改變免疫細(xì)胞的反應(yīng)性 抗原特異性（antigenic specificity）：具有能與特異抗體作用的性質(zhì) 全抗原（comp

5、lete antigen） 半抗原（hapten）：只能與特異抗體作用，但不引起機(jī)體免疫應(yīng)答的分子,.,2.2 藥物分子的抗原性,1、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物也是完全抗原。 2、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會發(fā)生改變。,.,3、藥物分析中，為了得到高效價的抗血清，通常會與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗。 常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。,.,（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng),多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋

6、白質(zhì)或多肽的游離羧基縮合形成肽鍵 甾體：通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連 抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接,.,（2）半抗原和載體的選擇原則,半抗原：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)的微環(huán)境；合理利用分子類似物之間的交叉反應(yīng)。 載體：載體對監(jiān)測系統(tǒng)的影響；載體效應(yīng)在免疫過程中的影響。,.,（3）合成抗原的測定,定性測定方法：光譜分析、熱力學(xué)分析 定量測定方法：相對含量測定；絕對含量測定。,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,.,免疫分析實際

7、上是一種特殊的試劑分析， 特點(diǎn)是抗體成為分析試劑。,.,1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能,抗體泛指與待測分子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）, 受體（receptor）和其他結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 .,.,免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。,.,抗體的基本結(jié)構(gòu),.,IgG分子由四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連，有三個功能區(qū)。 抗體在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時通過hi區(qū)的轉(zhuǎn)動以適應(yīng)不同距離的抗原決定簇。 與抗原結(jié)合后，IgG分

8、子構(gòu)象改變，暴露出Fc上的活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出固定和激活補(bǔ)體以及粘結(jié)單核細(xì)胞等親細(xì)胞反應(yīng)的功能。,Fab：抗原結(jié)合片段 Fc：可結(jié)晶片段,.,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,巰基乙醇還原,.,胃蛋白酶（pepsin）水解片段,裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（C端） 裂解片段，F(xiàn)（ab）2，無Fc片段 與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng),.,木瓜蛋白酶（papain）水解片段,裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（N端） 裂解片段，2個Fab（54KD），一個Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。,.,2抗體作為分析試劑的評價,抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需要簡單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性。 這兩點(diǎn)奠定了分

9、析免疫高度靈敏和高度專一的基礎(chǔ)。 此外，抗體還有一個獨(dú)特的性質(zhì)：每個抗體分子有兩個抗原的結(jié)合點(diǎn)，即多價性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號反差。,.,3、抗體的制備,（1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體）：指人工被動免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制備、動物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。,.,免疫原的制備,免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。 水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。 弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達(dá)到油包水的程度。 不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。

10、,.,動物免疫,通常的免疫動物為家兔和羊。 免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。 免疫抗原量通常為110mg或50100mg。,.,試血及效價測定,家兔的試血通?？捎啥夓o脈取血，取血量0.5ml。 不同稀釋度的抗血清和1%的血細(xì)胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測血細(xì)胞的凝聚情況，即可測得免疫血清的效價。,.,（2）單克隆抗體,單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。 高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個識別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)法 & 接種動物體內(nèi)生產(chǎn)法,.,制備步驟,.,2、抗體的純

11、化,利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。 利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專一性的抗體。,.,3、特異性抗體的篩選與效價測定,抗體的效價又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗體的效價指將血清稀釋，測定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價。 常用的效價測定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,四、免疫分析方法及其應(yīng)用,放射免疫分析法（RIA） 熒光免疫分析法（FIA） 克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA） 酶聯(lián)免疫吸附分析法（EL

12、ISA）,放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）,1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量范圍也明顯擴(kuò)大。 由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類競爭性體外放射分析技術(shù).,基本原理,基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測抗原）與有限量的特異性抗體

13、發(fā)生可逆性競爭結(jié)合 ,這種競爭可用以下反應(yīng)式來表示：,抗原 抗體,常用的標(biāo)記物：125 I和氚標(biāo)記物 放射性活度（貝克，Bp） 1Bp：每秒一次核衰變 比活度（Bp/g）： 每單位質(zhì)量所含的放射性比活度,游離狀態(tài),結(jié)合狀態(tài),具體步驟,抗原抗體反應(yīng),結(jié)合的和游離的 放射性物質(zhì)的分離,放射性活度的測定,柱色譜法 吸附法 沉淀法 抗抗體發(fā) 微孔濾膜法 固相法,求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）,熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）,免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項技術(shù) 以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合

14、、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原,熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）,在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位 在實際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù),根據(jù)實驗方法分類,直接法 間接法 補(bǔ)體法 其他,直接法,將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢 操作簡便、特異性高、非特異性染色少 敏感性低,抗原,標(biāo)記抗體,熒光,間接法,先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，

15、再用標(biāo)記的抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢,未知抗原,未標(biāo)記抗體,標(biāo)記抗體,熒光,補(bǔ)體法,利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光,補(bǔ)體,標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,時間分辨熒光免疫測定,利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強(qiáng)度，從而推測待測物含量。,基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。 測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 在這種測定方法中有3種必要的試劑： 固相

16、的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色劑）,酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）,雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。 它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。 其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。,實驗原理 雙抗體夾心法,酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。 具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 1、HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)。 供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長為492nm TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，用HCL或H2SO4終止后，由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長為405n