公開課講課用微生物的實驗室培養(yǎng)

1、到目前為止， 幾十項Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，化學(xué)獎 都與微生物學(xué)有關(guān),微生物的類群,原生生物：,原核生物:,真菌:,病毒:,如酵母菌,單細胞的動植物,如草履蟲、單細胞藻類等,無細胞結(jié)構(gòu),細菌、藍藻,原核細胞,微生物的共同特點：,個體微小、結(jié)構(gòu)簡單,1.細菌的形態(tài),擬核，大型環(huán)狀DNA,質(zhì)粒(小型環(huán)狀DNA，含抗生素等抗藥性和固氮的基因),其成分為肽聚糖,2.細菌的結(jié)構(gòu),細菌主要是以二分裂的方式進行增殖（如右圖）,3.細菌的繁殖,芽孢,有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。（抗逆性極強） 注：不是繁殖體,例

2、如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.,真菌是通過產(chǎn)生大量的孢子來繁殖后代的，霉菌的直立菌絲 頂端生有孢子，蘑菇的菌褶處也生有孢子，孢子隨風(fēng)飄散， 在適宜的環(huán)境條件下，能發(fā)育成一個新個體。單細胞的酵母 菌還可進行出芽生殖。孢子生殖和出芽生殖都是無性生殖。,課題1 微生物的實驗室培養(yǎng),專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,培養(yǎng)微生物需要解決的兩個問題是什么？,1、為其提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件 2、防止雜菌的入侵,培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件,無菌技術(shù) (獲得純凈培養(yǎng)物）,思考:,1.何為培養(yǎng)基？,3.不同的培養(yǎng)基

3、有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些營養(yǎng)元素？有何作用？請舉例說明。,閱讀教材P1415相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：,2.按照不同的培養(yǎng)基劃分標準，培養(yǎng)基有哪些種類、配制特點及其應(yīng)用？,一、培養(yǎng)基,（一）培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì),1.培養(yǎng)基概念,2.培養(yǎng)基的種類,常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種,用于微生物的分離、計數(shù),用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成如加入血清血漿等,根據(jù)細胞生存所需要的種類和數(shù)量用人工方法模擬合成,在培養(yǎng)基中加入（或缺少）某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。

4、例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。,根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。,含有一般微生物生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),固體培養(yǎng)基：菌落,單個

5、或少數(shù)菌體,2.特征：,大小、形狀、光澤度、 顏色、透明度等。,3.功能：,1.定義：,菌落,鑒定菌種的重要依據(jù),固體培養(yǎng)基上,大量繁殖,子細胞群體,幾種菌落及其形態(tài),幾種菌落及其形態(tài),3.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、無機鹽,碳源,無機碳源：,有機碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,糖類等含碳有機物質(zhì),自養(yǎng)微生物,異養(yǎng)微生物,氮源,無機氮源：,有機氮源：,NH4、NO3- 、N2 、NH3,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：有機C源為異養(yǎng)型微生物提供碳源和能源 含CHON的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源 N2（ 固氮微生物的唯一氮源 ）NH3 （既是硝化

6、細菌的氮源又是能源） 硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用,不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方,特殊營養(yǎng)物質(zhì)：生長因子,(3)常見的生長因子：,(1)概念：,(2)作用：,微生物生長不可缺少的微量有機物。,酶和核酸的組成成分。,維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。 一些天然物質(zhì)如酵母膏、蛋白胨、動植物組織提取液等可為微生物提供生長因子,（4）來源：,注意：,最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖 最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽 對異養(yǎng)生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白質(zhì) 之所以補充生長因子，是由于缺少合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限,此外，還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)（如

7、:生長因子)以及氧氣等的要求。,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。,分析營養(yǎng)構(gòu)成？,牛肉膏是用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。牛肉膏主要含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。此外含硫氨酸較多，而且含有更多的細菌生長需要的維生素和其它生長因子，是生物制藥發(fā)酵及和種培養(yǎng)基制備的基礎(chǔ)原材料。,蛋白胨是有機化合物。蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料

8、，在抗生素、醫(yī)藥工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生化制品及微生物學(xué)科研等領(lǐng)域中的用量均很大。,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 不加氮源的無氮培養(yǎng)基 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基,分離酵母菌、霉菌等真菌 （抑制細菌、放線菌的生長）,分離金黃色葡萄球菌,分離固氮菌,分離自養(yǎng)型微生物,4.配制原則,目的明確：,營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當,適宜的pH值：,有機碳源,異養(yǎng)型：,根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料,自養(yǎng)型：,不加碳源,加入緩沖劑,細菌偏堿，真菌偏酸,（CO2碳源）,C,課堂練,.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是( ) A碳源 B氮源 C無機鹽 D特殊營養(yǎng)物質(zhì),A,課堂

9、練,1.何為無菌技術(shù)？無菌技術(shù)包括哪些方面？,2.什么是消毒？滅菌？兩者有何區(qū)別？,3.常用的消毒與滅菌的方法有哪些？有何要求？,4.請說出干熱滅菌法和高壓蒸汽滅菌法的操作步驟。,二、無菌技術(shù),閱讀教材P15-P16相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：,獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？,二、無菌技術(shù),防止外來雜菌污染,1. 目的：,2. 方法：,消毒與滅菌,消毒與滅菌的概念和區(qū)別？,（）消毒定義： 利用較為溫和的化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,（2）滅菌的定義：,以強烈的化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程

10、。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min 或80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用70%酒精、新 潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,1、灼燒滅菌,(2)滅菌的方法：,2、干熱滅菌： 160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸汽滅菌： 100kPa、121 下維持15-30min.,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃

11、器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。,高壓蒸氣滅菌的原理是（ ） A高壓使細菌DNA變性 B高壓使細菌蛋白質(zhì)凝固變性 C高溫燙死細菌 D高溫使細菌DNA變性,B,關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是 A消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的 B滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物 的細胞、芽孢和孢子 C接種環(huán)用燒灼的方法滅菌 D常用滅菌方法有加熱法、過濾法、紅外線法、化學(xué)藥品法,A,1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

12、,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,2.無菌范圍：,實驗操作空間消毒,操作者的手、衣著消毒,實驗用具滅菌,實驗操作過程,酒精燈旁操作,超凈工作臺,三、實驗操作（大腸桿菌的純化培養(yǎng)）,（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）,1計算、稱量 2溶化 3調(diào)pH： pH76 4分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 5加塞

13、6包扎,操作步驟,包器材,包器材,7滅菌: 將裝有培養(yǎng)基的三角錐瓶，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 8倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 9無菌檢查： 將滅菌的未接種（或者接種無菌水）的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。,（二）純化大腸桿菌,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,微生物的接種技術(shù)：,原理：,想方設(shè)法在培養(yǎng)基上得到由一個細菌 繁殖

14、而來的肉眼可見的菌落，即獲得較 純的菌種。,涂布器,接種環(huán),接種針,三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：,制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,純化大腸桿菌（目的）,平板劃線法：,菌種,劃3個平板,1個不劃線,1.接種：,接種環(huán),防止劃破培養(yǎng)基,（重復(fù)實驗）,（空白對照）,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種

15、的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,6支試管，分別加入9ml無菌水,101,102,103,104,105,106,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液：,菌液,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液

16、：,b.涂布平板：,不超過0.1ml,各梯度分別涂布3個平板,1個不涂布作空白對照,滴,灼,冷,涂,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？,應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,平板劃線法：,稀釋涂布平板法：,2.培養(yǎng)：,將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基,放入37恒溫箱中培養(yǎng)12h24h后，,觀察并記錄,接種方法的判斷？,四.菌種的保藏：,1.臨時保藏：,試管固體斜面培養(yǎng)基上,4,2.長期保存：,菌種易被污染、變異,甘油管藏

17、,1ml甘油1ml菌液,20,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例:關(guān)于微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是( ) A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳

18、源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。,D,例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是( ) A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。,B,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答： （1