氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定

1、實驗九,氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定,丁鳴,一、實驗?zāi)康暮鸵?1、學(xué)習(xí)鑒定氨基移換反應(yīng)的簡便方法及其原理； 2、學(xué)習(xí)紙層析的原理和操作技術(shù)。,二、實驗基本原理 1.氨基移換反應(yīng)： 在氨基移換酶（轉(zhuǎn)氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之間發(fā)生的互換反應(yīng)。 轉(zhuǎn)氨酶的種類很多，任何一種氨基酸進行轉(zhuǎn)氨作用時都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。轉(zhuǎn)氨酶的最適pH接近7.4，在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性最強。 轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機體的各種組織中。在肝、心、腎等組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic

2、 oxalacetic transaminase,GOT）活性較高。,GPT催化下的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)為：,L谷氨酸脫氫酶在體內(nèi)特別是在肝細胞內(nèi)含量豐富，活性高，催化L谷氨酸氧化脫NH2，加碘乙酸能抑制其活性，從而可以保護氨基移換反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)谷氨酸。 本實驗用紙層析法，檢查由丙氨酸和酮戊二酸在肝細胞谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，證明組織內(nèi)的氨基移換作用。,2. 紙層析原理： 濾紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。利用不同物質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中分配情況（溶解度）的不同來分離混合物的一種技術(shù)。 層析溶劑是由有機溶劑和水組成。濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附一層水作為固定相，而通常

3、把有機溶劑作為流動相。進行分離時，由于被分離物質(zhì)的組分在兩相中的分布不同，隨著流動相的移動，物質(zhì)將在兩相間進行連續(xù)的、動態(tài)的不斷分配，從而造成不同組分移動的速度也不相同。易溶于流動相中的組分移動快，在固定相中溶解度大的組分移動慢，于是得到分離。,溶質(zhì)在濾紙上的移動速率用Rf值表示：,X原點到層析斑點中心距離 Y原點到溶劑前沿的距離,在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf 值是常數(shù)。Rf值的大小與樣品的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)（溶劑的性質(zhì)、溶劑的pH）、層析的溫度和層析濾紙有關(guān)。此外，樣品中的鹽分，其他雜質(zhì)以及點樣過多皆會影響樣品的有效分離。,用濾紙層析法分離氨基酸，是根據(jù)氨基酸樣品的R基團的化學(xué)結(jié)構(gòu)或極性大

4、小的不同，將樣品氨基酸溶解在適當?shù)娜軇?0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液）中，點樣在濾紙的一端，再選用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)（酚溶液），通過毛細現(xiàn)象向另一端展層，展層完畢后，用茚三酮作為顯色劑，即可得到氨基酸樣品的分離圖譜。,3. 茚三酮的顯色原理： 氨基酸+茚三酮類 紫紅色復(fù)合物,80,三、實驗材料與試劑 1、實驗材料 動物肝臟(牛蛙肝或豬肝） 2、實驗試劑 0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）（轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)所需緩沖溶液）； 0.1mol/L丙氨酸（pH7.4）（轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的底物，紙層析的標準樣品）； 0.1mol/L酮戊二酸（pH7.4）（轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的底物）； 0.1mol/L谷氨酸

5、（pH7.4）（紙層析的標準樣品）； 展層溶劑酚溶液：水飽和酚：冰乙酸（300：1）（紙層析用）； 10三氯乙酸（終止酶促反應(yīng)，使轉(zhuǎn)氨酶及其它蛋白質(zhì)變性、沉淀）； 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脫氫酶活性）； 顯色劑（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。,四、實驗器材與儀器 研缽； 試管及試管架； 恒溫水浴箱（37、100）； 鉛筆、尺和圓規(guī)； 毛細管（直徑0.5mm)； 新華定性濾紙（直徑11cm）； 剪刀和鑷子； 電吹風(fēng)； 滴管； 康氏皿； 噴霧器； 烘箱（80 ）。,五、實驗操作方法和步驟 1、轉(zhuǎn)氨酶液的制備 取新鮮牛蛙肝或豬肝約3g，剪碎用研缽將肝臟碾碎，加3ml磷酸緩沖液迅速碾磨，加9ml磷

6、酸緩沖液，用兩層紗布過濾，收集漿液或濾液即得轉(zhuǎn)氨酶提取液備用。 2、氨基移換反應(yīng) 取4支潔凈、干燥的試管，按表1操作,表1,5.5cm,1cm,用鉛筆作出點樣位置,用鉛筆尖在圓心處截一小孔,3、層析 準備： 取新華定性濾紙（直徑11cm）一張，找出圓心，用圓規(guī)畫一直徑2 cm的細圓圈（保持干凈），并按圖1用鉛筆作出點樣位置。找出圓心，用鉛筆尖在圓心處截一小孔（孔徑約0.2cm)。 另取2cm3cm濾紙，先將下端剪成須狀，卷成“燈芯”，備用。,2cm,3cm, 點樣：用毛細管依次點標準丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各點2次，其余14號管樣液各點23次。點樣時，要待前次點樣干燥（可用電吹風(fēng)吹

7、干）后方可再次點樣，點樣直徑不超過0.3cm。,2,11號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ） 22號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ） 33號管反應(yīng)樣液 44號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 、谷氨酸） 5標準樣液：丙氨酸 6標準樣液：谷氨酸,3,2,4,5,1,6, 展層、顯色 將下端剪成須狀,卷成的“燈芯”，然后將上端插入層析濾紙圓心處的小孔中, 平放在盛有展層溶劑的康氏皿中,使“燈芯”下端須狀浸入展層溶劑中,再在濾紙上蓋上另一康氏皿（圖1）。展層劑沿?zé)粜纳仙綖V紙,再向四周擴散,待溶劑前沿距康氏皿外槽內(nèi)緣0.5cm(約需半小時)，取出濾紙，用鑷子拔出燈心，濾紙用電吹風(fēng)吹干，再用噴霧器向濾紙均勻噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液，用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干或放入烘箱（80 ）中顯色3min。,4,3,2,圖1層析裝置示意圖,1. 康氏皿 2. 展層溶劑 3. “燈芯” 4. 層析濾紙,1,谷氨酸,丙氨酸,丙氨酸,氨基酸樣品的分離圖譜,溶劑前沿,原點,6,5,1,2,3,4,氨基酸樣品的分離圖譜,六、結(jié)果分析討論 七、思考題 1.為什么要設(shè)計4支反應(yīng)管？每管所要說明的問題是什么？ 2. 觀察實驗現(xiàn)象，并對層析后氨基酸的顯色