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文檔簡介

1、實驗三 脲酶的Km值簡易測定,1926年，美國生化學家Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，并證明了脲酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。1946年獲得諾貝爾化學獎。,酶,是由活細胞合成的，對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是機體內(nèi)催化各種代謝反應(yīng)最主要的催化劑。,酶的特征常數(shù),Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度 酶促反應(yīng)的特征常數(shù)只與酶的結(jié)構(gòu)、底物和反應(yīng)環(huán)境（如溫度、pH、離子強度）有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。,實 驗 目 的,闡述酶促反應(yīng)中特征常數(shù)的特點和意義； 說出利用比色法進行Km值測定的整個操作步驟； 思考Km值的測定對臨床工作中的意義。,一 、原理,米曼氏方程（Michaelis-Menten

2、 equation）,V=,Vmax S,Km + S,米-曼氏方程解釋： 當SKm時，v Vmax S /Km， 即v正比于S 當SKm時，v Vmax, 即S而v不變,Km值：當酶反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，單位是molL。 Km值最小的底物稱為該酶的最適底物也就是天然底物。,V,=,Km=S,=,底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響,v Vm Vm 2,0 S,S與v關(guān)系： 當S很低時，S與v成比例- 一級反應(yīng) 當S較高時，S與v不成比例 當S很高時，S，v不變-零級反應(yīng),Km值與 Vmax值測定,雙倒數(shù)作圖法又稱林-貝氏作圖法（1934） 1 = Km 1 + 1 V Vmax

3、S Vmax,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,酶促反應(yīng)的原料,底物（脲液） 酶（脲酶液） 酶促反應(yīng)所需的緩沖液（PBS，蒸餾水等） 酶促反應(yīng)發(fā)生的環(huán)境（堿性條件，加入NaOH；溫度，37）,操作中每種試劑務(wù)必搖勻 煮沸脲液時注意試管口不能對人，變性脲酶液要煮沸變性徹底 試管一定要清洗干凈，防止其他殘留液體對實驗的影響 各組試管加樣注意一致性，防止人為加樣造成的誤差。重復測值，取平均數(shù)值,注意事項,實驗操作,充分搖勻，靜置5min，過濾，分別在濾液中加入以下試劑,迅速搖勻，用721型分光光度計，420nm，以對照調(diào)零，測定各管A值。,討論小結(jié),酶促反應(yīng)有什么特點？ 測定酶促反應(yīng)特征常數(shù)Km值有意義？,思考題：,1、

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