流感病毒的快速檢測方法#嚴(yán)選優(yōu)質(zhì)

1、流感病毒的快速檢測方法一、RT-PCR快速診斷方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR 產(chǎn)物純化（五）流感病毒RT-PCR檢測引物二、免疫熒光方法檢測流感病毒（一）原理（二）標(biāo)本處理（三）間接免疫熒光法（四）結(jié)果判斷三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）快速診斷檢測（一）基本原理（二）實(shí)驗(yàn)試劑（三）實(shí)驗(yàn)步驟四、快速診斷試劑盒流感的快速檢測方法，與傳統(tǒng)的病毒分離鑒定相比具有快速、簡便的特點(diǎn)。因此常用于流感暴發(fā)時(shí)早期病原學(xué)檢測用。流感的快速診斷包括直接和間接免疫熒光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速診斷速方法、流感快速診斷試劑盒

2、等。這里介紹RT-PCR、Real-Time PCR、免疫熒光快速診斷速診斷方法和幾種流感快速診斷試劑盒優(yōu)缺點(diǎn)。無論那種快速診斷都無法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒分離鑒定方法。一、 RT-PCR快速診斷方法核酸檢測是一種鑒定流感病毒基因組的有力方法，即使基因組含量很低或死病毒也可以檢測到。本章將介紹檢測流感病毒的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。流感病毒的基因組是負(fù)鏈RNA，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前必須合成與病毒RNA互補(bǔ)的DNA，即為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，擴(kuò)增流感病毒基因組的過程稱為RT-PCR。 RT-PCR需要一對(duì)型別特異引物，四種脫氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆轉(zhuǎn)錄

3、酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后再進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)經(jīng)2530個(gè)循環(huán)，使DNA產(chǎn)物達(dá)到倍增的效果。（一） 生物安全要求生物安全級(jí)別與個(gè)人防護(hù)要求：生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，防護(hù)要求與二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的要求相同。并應(yīng)遵守相應(yīng)的生物安全規(guī)定。進(jìn)行高致病性禽H5 RT-PCR快速檢測時(shí)可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，核酸提取在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里完成。（二） 病毒核酸提取1. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）(2) -巰基乙醇（-mercaptoethanol）(3) 70% 乙醇(4

4、) 無菌1.5ml 離心管(5) 10l、20l、200l、1000l加樣器和槍頭(6) 可調(diào)14K微型離心機(jī)(7) 旋轉(zhuǎn)混合器2. 操作步驟(1) 取1支無菌、無RNA酶的1.5ml Eppendorf管，加入500l RLT。(2) 取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）100l，加入上述Eppendorf管中。(3) 加5l -巰基乙醇，充分混勻。(4) 加600l 70%乙醇，于旋轉(zhuǎn)混合器混勻。(5) 從試劑盒中取出帶濾膜的離心柱，并標(biāo)上標(biāo)本號(hào)。(6) 將第4步的混合液體分兩次（每次600l） 吸入于濾柱中，12000rpm 離心15秒，棄收集管中的離

5、心液。(7) 濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm 離心15秒，棄收集管中液體。(8) 于濾柱中加入700l RW1，12000rpm 離心15秒。(9) 從試劑盒中取出一支新的2ml收集管，將離心后的濾柱轉(zhuǎn)到新的收集管上，于柱子中加入500l RPE，12000rpm 離心15秒棄收集管中液體。(10) 濾柱放回收集管上，于濾柱中加入500l RPE，1300014000rpm 離心2分鐘。(11) 從試劑盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，將濾柱轉(zhuǎn)到新的1.5ml管上，于濾柱中加入3050l 無RNA酶的水，室溫靜置13分鐘。(12) 12000r

6、pm 離心1分鐘，棄濾柱。收集的離心液即為提取病毒的RNA，可以直接用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，或在-20以下保存，-30可保存34個(gè)月。3. 注意事項(xiàng)(1) 試劑盒中的RPE液用前需加44ml無水乙醇，使終體積達(dá)到55ml。(2) 所有用過的槍頭、收集管放入2%次氯酸鈉消毒缸中過夜。（三） RT-PCR1. 一步法 RT-PCR(1) 實(shí)驗(yàn)材料1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 2102122) RNase inhibitor 40u/l（Promega）3) 上游引物 200ng/l4) 下游引物 200ng/l5) 模板RNA（Templet RNA）(2) 實(shí)

7、驗(yàn)步驟1) PCR反應(yīng)配置（在清潔區(qū)緩沖間，加RNA模板應(yīng)在核酸室）無RNA酶水（Rnase Free Water） 28.75l5Buffer 10l10mM dNTP 2l Enzyme Mix 2lRnase inhibitor 0.25l上游引物 1l下游引物 1lRNA 模板 5l 總量：50l2) 將PCR 反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀3) RT-PCR 反應(yīng)條件：此循環(huán)的反應(yīng)條件僅共參考，如果引物更換，相應(yīng)的反應(yīng)條件需要做適當(dāng)調(diào)整。 60 1 min 42 10 min 50 30 min 95 15 min 94 30 sec 52 30 sec 72 1 min 返回第 5部，循環(huán)

8、34次 72 10 min 4 保存4) PCR產(chǎn)物檢測瓊脂糖凝膠配置：用1TBE 將瓊脂糖配成1.2%1.5%溶液，加熱使之完全溶解。冷卻到5060時(shí)加入溴化乙錠（Ethidium Bromide EB，10ug/l），終濃度為0.5g/ml。PCR產(chǎn)物檢測：將凝膠放入電泳槽,加入1TBE Buffer ，使它淹沒過膠面。每份標(biāo)本取4l PCR產(chǎn)物，與1l 5Loading Buffer 充分混勻后全加入凝膠孔中。于同一凝膠的第一孔加入5l分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品。加完樣后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，穩(wěn)壓100v，電泳時(shí)間約3040min。結(jié)果分析：用UV254暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果，在透射波長

9、254nm 下觀察結(jié)果效果較好。或者用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。5) 注意事項(xiàng)：含EB的瓊脂糖經(jīng)處理后放入科研垃圾袋內(nèi)統(tǒng)一處理。含有EB的凝膠處理方法： 加1倍體積的0.5mol/L KMnO4,小心混勻。 加入1倍體積的2.5 mol/L HCl,小心混勻。于室溫放置數(shù)小時(shí)。 加入1倍體積的2.5 mol/L NaOH,小心混勻后即可丟棄。2. 二步法 RT-PCR(1) 實(shí)驗(yàn)材料1) 逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV Reverse Transcriptase，Catalog# M5101 Paromeg2) 5RT Buffer3) 2.5mM dNTP4) Rnase inhibitor 40u/l（

10、Promega）5) 上游引物 200ng/l6) 下游引物 200ng/l7) 無RNA酶的水（Rnase Free Water）8) Ex-Taq 酶 5u/l DRR 001A 250u （Takara）9) 10PCR Buffer(2) 實(shí)驗(yàn)步驟1) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（在清潔區(qū)緩沖間，加RNA模板在核酸提取室）無RNA酶的水 6.8l5RT Buffer 4l2.5mM dNTP 2l上游引物 1lRnase inhibitor 0.2l逆轉(zhuǎn)錄酶 1lRNA 模板 5l 總量：20l將上述反應(yīng)液混勻，42水浴作用1小時(shí)。然后94 3min ，放置冰上（下步PCR反應(yīng)或-20 待用）2) P

11、CR反應(yīng)配置（在清潔區(qū)緩沖間，加cDNA模板應(yīng)在PCR擴(kuò)增室）無RNA酶的水 35.5l10PCR Buffer 5l2.5mM dNTP 2l 上游引物 1l下游引物 1lEx-Taq 酶 0.5lcDNA 模板 5l 總量：50l3) 將PCR 反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀4) PCR 反應(yīng)條件：此循環(huán)的反應(yīng)條件僅共參考，如果引物更換，相應(yīng)的反應(yīng)條件需要做適當(dāng)調(diào)整。 94 3 min 94 40 sec 52 40 sec 72 2 min 返回第2部，循環(huán)30 次 72 7 min 4 保存 PCR 產(chǎn)物檢測：同一步法（四） PCR 產(chǎn)物純化1. 實(shí)驗(yàn)材料QIAquick Gel Extrac

12、tion Kit Cat No 287042. 操作步驟(1) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；(2) 用干凈的手術(shù)刀切割目的DNA片段，將切下的DNA膠放入1.5ml離心管（切膠在暗箱或紫外透射儀下操作）；(3) 加3倍膠體積的Buffer QG（即100mg DNA膠加300l Buffer QG）；(4) 水浴50 孵育10min，直到DNA膠完全溶解（每隔23min 用旋轉(zhuǎn)混合器混勻）；(5) 加一個(gè)膠體積的異丙醇（100mg DNA膠加100l異丙醇）；(6) 從試劑盒 中取出帶濾膜的離心柱收集管，并標(biāo)上標(biāo)本號(hào)；(7) 將上述DNA液吸入帶濾膜的離心柱，13000rpm離心1min，

13、棄收集管中廢液，再將帶濾膜的離心柱放回收集管；(8) 于帶濾膜的離心柱中加0.5ml Buffer QG，13000rpm離心1min，棄收集管中廢液；(9) 帶濾膜的離心柱中加入0.75ml Buffer PE，放置25min，13000rpm離心1min，棄收集管中廢液，再將帶濾膜的離心柱放回收集管上，13000rpm離心1min；(10) 將帶濾膜的離心柱轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml離心管上；(11) 于帶濾膜的離心柱中加2030l TE（或Rnase Free Water），室溫35min，12000rpm離心1min，棄小柱，收集的離心液即為純化的PCR產(chǎn)物，可直接用于測序。（五） 流感病

14、毒RT-PCR檢測引物A型檢測引物： 5 CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT 5 GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACTB型檢測引物 5 GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG5 TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TGH1亞型鑒定引物 5 ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC 5 CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,CH3亞型鑒定引物 5 ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC 5 ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,CH5亞型鑒定引

15、物 5 GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG 5 GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCCH5亞型鑒定引物 5 GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA 5 YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGAH5亞型鑒定引物 5 GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC 5 CTC,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TGN1鑒定引物 5 AAG,GGG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT 5 TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCCN2鑒定引物 5 GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC

16、,ATT,G 5 AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC二、 免疫熒光方法檢測流感病毒（一） 原理流感病毒主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，因此在病人呼吸道標(biāo)本的脫落細(xì)胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查上皮細(xì)胞內(nèi)病毒特異性抗原即可診斷。（二） 標(biāo)本處理標(biāo)本采集最好用負(fù)壓抽取法收集的呼吸道分泌物。1. 在標(biāo)本中加入維持培養(yǎng)液至總體積為4 ml。2. 使用吸管吹打懸浮液數(shù)次。3. 2000 rpm離心5分鐘。4. 保留上清液做培養(yǎng)。5. 用10 ml pH7.2 PBS清洗細(xì)胞沉淀，棄上清。6. 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新懸起沉淀。（三） 間接免疫熒光法1. 在特富龍涂

17、層的12孔顯微載玻片的每個(gè)孔上加入10 l細(xì)胞懸浮液。2. 用載玻片干燥器干燥載玻片或室溫自然干燥。3. 用100%冰丙酮室溫10分鐘固定載玻片。4. 室溫晾干載玻片。5. 每孔加10 l 流感相應(yīng)亞型的特異性抗體（1:1000）6. 玻片在濕盒中37 放置45分鐘。7. pH7.2 PBS洗滌1分鐘。8. 室溫晾干載玻片。9. 每孔加入10 l 1:20 兔抗鼠熒光素結(jié)合物（二抗），及0.1 % 伊紋氏藍(lán)（Evans Blue）做負(fù)染。10. 玻片在濕盒中37 放置45分鐘。11. pH7.2 PBS洗滌1分鐘。12. 室溫晾干載玻片。13. 加上蓋玻片，加上甘油。14. 在400X 熒光顯

18、微鏡鏡下檢查。（四） 結(jié)果判斷陽性訊號(hào)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蘋果綠色熒光，陰性細(xì)胞顯示為深紅色的細(xì)胞質(zhì)部分。觀察到三個(gè)以上熒光陽性即可判為陽性。三、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）快速診斷檢測（一） 基本原理實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time）RT-PCR術(shù)，是指在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)RT-PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。1. 熒光基團(tuán)主要有TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料(1) TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)

19、和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)可被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5-3外切酶活性將與PCR產(chǎn)物雜交形成雙鏈的探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 (2) SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2. 相關(guān)的幾個(gè)概念(1) Ct值：C代表CyCle，

20、t代表threshold。Ct值是指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) 。(2) 閾值（threshold）：PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是615個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。(3) 基線（baseline）：指PCR反應(yīng)指數(shù)擴(kuò)增前平均本底熒光信號(hào)值，通常取615個(gè)循環(huán)的平均熒光信號(hào)值。(4) Ct值與起始模板的關(guān)系：每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算

21、出該樣品的起始拷貝數(shù)。 （二） 實(shí)驗(yàn)試劑1. 引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物2. RT-PCR酶3. RT-PCR反應(yīng)液4. Taq酶5. 無RNA酶的水6. 陽性對(duì)照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA）7. 陰性對(duì)照 8. 無RNA酶的水（三） 實(shí)驗(yàn)步驟1. 核酸提取方法同RT-PCR的快速診斷。2. RT-PCR反應(yīng)體系配置(1) 配置反應(yīng)體系從試劑盒中取出相應(yīng)的 RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，反應(yīng)液在室溫下融化后，2000rpm離心5秒鐘。設(shè)所需PCR數(shù)為n（n = 樣本數(shù) + 1管陰性對(duì)照 + 1管陽性對(duì)照），每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：試劑RT-PCR反應(yīng)液Taq酶用量9.8

22、l0.2l計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，向其中加入n/2顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝10l。(2) 加模板在各設(shè)定的PCR管中分別加入RNA溶液各10l，蓋緊管蓋，放入熒光 PCR熒光檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。3. RT-PCR反應(yīng)(1) 循環(huán)條件設(shè)置程序循環(huán)數(shù)溫度（攝氏度）反應(yīng)時(shí)間（分鐘:秒）114230:0021923:003592104530721:004409210603051400(2) 儀器檢測通道選擇F1通道1) 結(jié)果分析條件設(shè)定讀取F1通道的檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)?；蚩筛鶕?jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。2) 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照的檢測結(jié)果為陰性。陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。4. 結(jié)果判斷1) Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本。2) Ct值30.0的樣本為陽性。3) Ct值大于30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性