藥物設計學 11第十一章 基于片段的藥物分子設計

1、第十一章 基于片段的藥物分子設計 Fragment-Based Drug Design,2,內(nèi)容提要,第一節(jié) 基于片段的分子設計原理 第二節(jié) 活性片段的檢測技術 磁共振技術 質(zhì)譜技術 X-射線單晶衍射技術 第三節(jié) 從片段到先導化合物,3,基于片段的藥物設計 Fragment-Based Drug Design FBDD,是一種將隨機篩選和基于結構的藥物設計結合的藥物發(fā)現(xiàn)新方法。 首先篩選得到低分子量和低親和力的片段，然后基于藥靶結構信息將片段進行優(yōu)化或連接，得到與藥靶親和力高且類藥性強的新分子。,4,1.發(fā)展背景高通量篩選的缺陷 盲目性大，命中率很低。理論計算，含有30個重原子的化合物有106

2、0種，而高通量篩選的化合物數(shù)即使以百萬計(106)，篩選也只占很少部分。 對于部分藥物靶點很難篩選得到理想的化合物，命中化合物的類藥性較差。化合物分子量比較大，親脂性強，優(yōu)化成藥的難度大。,一、發(fā)展歷程和基本理論,第一節(jié) 基于片段的分子設計原理,5,許多藥靶的活性位點是由多個口袋組成。高通量篩選的化合物過于“成熟”，通常不能與靶蛋白很好地結合，而對于其中單個片段的優(yōu)化往往會影響整個分子，甚至導致結合位置的改變。,6,苗頭化合物(hit)多以活性強度為衡量標準。hit-to-lead和先導物優(yōu)化，大都加入或變換基團，以增加與靶標結合的機會和強度。一般“不敢”輕易去除基團或片斷，以免丟失參與結合的

3、原子或基團(即藥效團)。 公司之間的化合物的結構類型相似，篩選靶標相同，易有知識產(chǎn)權糾葛。,7,設計理念 藥靶的活性位點是由多個口袋組成； 尋找能與藥靶各個口袋特異性結合的片段； 將上述各個片段用合適的連接子連接起來，組成高活性的化合物。將片段連接后會引起結合自由能跳躍式下降，從而導致親和力大幅度提高。,2. 應對策略基于片段的藥物設計,8,基于片段的藥物設計分為三個階段 片段篩選。采用靈敏的檢測技術篩選片段庫，發(fā)現(xiàn)能與藥靶結合的片段。結合力較弱，一般為mM級。 確定片段與藥靶結合的結構信息?？疾炱闻c藥靶結合區(qū)域以及如何相互作用。 根據(jù)片段與藥靶相互作用的結構信息來指導對片段進行優(yōu)化或衍生化

4、，或?qū)⒆饔糜诓煌诖钠芜B接，構建新分子。,二、研究方法,9,片段庫的建立 片段庫三因素 庫容量(100010000)、化學結構多樣性、類藥性 片段類藥性三原則(RO3) 分子量300(160250)、氫鍵供體或受體數(shù)目3、脂水分配系數(shù)log P 3 避免具有不合理的基團且易于衍生化 片段庫的篩選 生物化學檢測、磁共振、質(zhì)譜、X-射線單晶衍射,二、研究方法,10,結構信息的確定 確定片段與藥靶結合的結構信息對于指導片段轉(zhuǎn)化為先導化合物起至關重要的作用。 磁共振、質(zhì)譜、X-射線單晶衍射 基于片段構建新分子 基于片段藥物設計的最終目標就是要發(fā)現(xiàn)先導化合物甚至是候選藥物。 利用藥靶活性位點與片段相

5、互作用的結構信息，在片段基礎上進一步設計新的分子。,二、研究方法,11,化學結構多樣、命中率高 高通量篩選106 /1060 VS 片段篩選104 /107 化學結構多樣,二、基于片段分子設計的優(yōu)點,12,發(fā)現(xiàn)新藥可行性高 將高通量篩選得到的先導物優(yōu)化為候選藥物，既要使活性有較大幅度提高，又要保持分子量基本不變，難度較大。 而從片段優(yōu)化至候選藥物，分子量和活性同步增長，更加符合新藥發(fā)現(xiàn)的一般規(guī)律，可行性更強。,二、基于片段分子設計的優(yōu)點,13,二、基于片段分子設計的優(yōu)點,14,基本原理 配體與生物大分子結合后，許多NMR參數(shù)(化學位移)會發(fā)生改變，通過檢測并分析這些數(shù)據(jù)，可以來判定配體是否與受

6、體結合、結合的強弱以及結合模式。 分類 檢測配體的篩選 LDBS 檢測受體的篩選 TDBS,一、磁共振技術,第二節(jié) 活性片段的檢測技術,15,檢測配體的篩選 LDBS 1.1 原理 弛豫時間長短與分子大小成反比，小分子化合物的弛豫時間長，大分子靶蛋白的弛豫時間短。 當藥物與靶蛋白結合后就變成大分子，弛豫時間變短。 只要適度延遲回復能量檢測時間，就可以做到只檢測到游離小分子藥物，而檢測不到大分子靶蛋白及其與小分子化合物的復合物。,16,檢測配體的篩選 LDBS 1.2 操作步驟 普通條件測定小分子化合物的NMR譜； 向小分子中加入靶蛋白； 向磁共振儀引入一個適當?shù)难訒r使靶蛋白分子檢測不到，再測一

7、次。 譜圖不變未結合； 譜圖改變結合，計算結合率。,17,檢測配體的篩選 LDBS 1.3 優(yōu)點 不僅可檢測純化合物，也可篩選混合物。因此對天然產(chǎn)物的研究和組合化學研究特別方便。 速度快，可直接確定與靶蛋白結合的片段。 靈敏度高，弱結合也能檢測到。 對靶蛋白要求低，無需確定結構，無需進行放射性核素標記，避開對靶蛋白分子量的限制。,18,檢測配體的篩選 LDBS 1.3 缺點 不能獲得靶蛋白結合位點的信息以及片段在結合位點的取向。 受配體溶解性限制，存在非特異性結合的假陽性問題。,19,檢測配體的篩選 LDBS 1.4 修正報告配體篩選方法 操作 在篩選樣品中加入一個已知能與藥靶某一區(qū)域具有弱結

8、合的分子，稱為報告配體或者探針。 片段分子可競爭性地與報告配體結合藥靶，親和力高于報告配體的片段分子被檢測出來。 這種方法得到片段與報告配體結合到藥靶相同區(qū)域，避免檢測到與藥靶非功能區(qū)域結合的片段，有效降低假陽性。,20,檢測受體的篩選 TDBS 2.1 先決條件 已知靶蛋白的結構 對靶蛋白進行15N標記 2.2 原理 當小分子與靶蛋白結合后，會改變結合位點局部的化學環(huán)境，通過15N標記蛋白的二維15N-HSQC譜圖，可以找到各酰胺信號15N或1H的化學位移變化。,21,檢測受體的篩選 TDBS 2.3 優(yōu)點 不僅可以檢測是否結合，還可以檢測結合位點。 準確度高，特異性強。 2.4 缺點 僅適

9、于分子量小于40000的靶蛋白； 需進行15N標記，而且能制備200 mg以上的量 。,22,磁共振構效關系研究法 SAR-by-NMR 3.1 原理 通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學位移變化來檢測是否有小分子與靶蛋白結合。 配體和蛋白結合常數(shù)可通過化學位移的變化和配體濃度關系測得。 篩選得到結合于靶分子活性位點亞區(qū)域的低親和性配體，將這些配體連接可以得到具有較高親和力的配體。,23,磁共振構效關系研究法 SAR-by-NMR 3.2 實例Stuker發(fā)現(xiàn)FK506蛋白抑制劑,24,非共價結合電噴霧質(zhì)譜 ESI 1.1 原理 將片段與靶蛋白配成混合液，設定合適的離子化條件，將片段

10、-靶蛋白復合物由液相轉(zhuǎn)化為氣相，測定荷質(zhì)比(m/z)，從而得到結合片段的分子量，進而確定是哪一個片段與藥靶結合。 繼續(xù)運用色譜技術分離得到片段-靶蛋白復合物，并將片段解離，通過測定濃度，計算得到親和力。,二、質(zhì)譜技術,25,非共價結合電噴霧質(zhì)譜 ESI 1.2 實例發(fā)現(xiàn)細菌U1061A功能域配體,26,共價結合Tether方法 2.1 原理 靶蛋白的半胱氨酸殘基巰基與連有二硫鍵側鏈片段形成新的二硫鍵。 含二硫鍵片段組成：片段母體、連接基團、離去基團(2-巰基乙胺)。,二、質(zhì)譜技術,27,共價結合Tether方法 2.2 操作 考察靶蛋白活性口袋附近是否含有內(nèi)源性半胱氨酸殘基，如果沒有，則采用定

11、點突變引入半胱氨酸殘基。 將片段庫中的片段都連上相同的巰基側鏈，將靶蛋白置入片段的高濃度溶液中。在溶液中片段和靶蛋白的二硫鍵的形成和解離達到動態(tài)平衡。 片段和靶蛋白結合不僅能形成二硫鍵，而且片段還會與附近的活性口袋結合，從而形成更穩(wěn)定的片段-靶蛋白共價復合物。,28,共價結合Tether方法 2.2 操作 溶液中活性片段-靶蛋白復合物的濃度遠高于其他復合物，在質(zhì)譜圖上可以輕易識別出活性片段。根據(jù)插入半胱氨酸殘基位置的不同，還可以判斷結合位置。 通過二次Tether技術可以篩選得到相鄰位點的活性片段。然后將兩個片段以合適的連接子連接，得到高活性化合物。,29,共價結合Tether方法 2.3 優(yōu)

12、點 片段和藥靶之間形成了穩(wěn)定并且可逆的二硫鍵。用質(zhì)譜快速檢測得到與藥靶具有較好契合的片段，降低假陽性率。 可精確定位片段在藥靶活性位點的位置。 2.4 缺點 需要采用定點突變技術在藥靶活性位點引入半胱氨酸殘基。 片段庫中，商業(yè)化的二硫鍵片段很少，需自行合成，增加了實驗的難度。,30,共價結合Tether方法 2.5 二次Tether技術 原理 用一個已知活性片段對靶蛋白進行共價修飾，然后將片段潛在的另一個巰基游離出來，用Tether方法去結合新的片段。 已知活性片段 具有親電的特征(例如含有易離去基團)； 含有一個潛在的巰基(如硫酯),31,2.6 實例采用二次Tether方法發(fā)現(xiàn)高效casp

13、ase-3抑制劑,32,X-射線單晶衍射技術是研究分子結構最有效和最精確的方法。 結晶篩選 通過共結晶和結晶浸潤技術，靶蛋白可以快速識別并結合活性片段形成復合物，后者的三維結構可通過高通量X-射線衍射技術快速測定。 技術原理 片段庫含溴片段(利于測定、易于衍生化) 篩選過程靶蛋白晶體結構的測定、建立結晶篩選技術平臺、片段庫的結晶篩選、結果分析和片段優(yōu)化。,三、X-射線單晶衍射技術,實例SGX發(fā)現(xiàn)Syk抑制劑,34,發(fā)現(xiàn)活性片段僅僅是研究的第一步，將活性片段轉(zhuǎn)化變?yōu)橄葘Щ衔锷踔潦呛蜻x藥物才是基于片段藥物設計的最終目的。 從片段到先導化合物的設計方法 片段生長 fragment growth 片段連接與融合 fragment linking & fusion 片段自組裝 fragment self-assembly,第三節(jié) 從片段到先導化合物,35,1.1 基本原理 以受體結合的第一個片斷為核心，經(jīng)過理性設計，在鄰近處逐漸生長成活性強的較大分子,一、片段生長法,36,1.2 實例Plexxikon發(fā)現(xiàn)PPAR激動劑indeglitazar,Dean R. Artis, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA.2009, 106(1): 262-7.,37,1.1 基本原理 連接 與受