RT-PCR原理及載體選擇

1、1,R T-P C R 與 表 達(dá) 載 體 的 選 擇,2,表達(dá)載體,表達(dá)載體（Expression vectors）就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體。 表達(dá)載體是基因表達(dá)的核心元件。, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,3,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR) 是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。,4,RT-PCR 原理,熒光閾值 是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)

2、置是基線(xiàn) （背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。, 擴(kuò) 增 曲 線(xiàn) ,5,RT-PCR 原理,CT值 是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的 域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)具有重現(xiàn)性。, 擴(kuò) 增 曲 線(xiàn) ,6,RT-PCR的數(shù)學(xué)原理,7,CT,8,PCR 反應(yīng)的對(duì)照,9,PCR 反應(yīng)條件, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,10,TaqMan 探針?lè)? 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,11,SYBR Green I熒光染料法,SYBR Green I是一種只與dsDNA小溝 結(jié)合的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)熒光染料。, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,12,SYBR Green I原理, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,13,兩種方法的比較, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,14,熒光定量的解析方法,15,PCR 反應(yīng)體系,10PCR Buffer(含Mg2+ ) 2 uL dNTPs(各2.5mmol/L) 2 uL 引物(10umol/L) 各1 uL 模板 2040 ng rTaq DNA聚合酶 0.5 U 加雙或三蒸水至 20 uL, 試 驗(yàn) 總 結(jié) ,16,絕對(duì)定量分析法,根據(jù)起始濃度與循環(huán)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷