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文檔簡介

1、1,R T-P C R 與 表 達(dá) 載 體 的 選 擇,2,表達(dá)載體,表達(dá)載體（Expression vectors）就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體。 表達(dá)載體是基因表達(dá)的核心元件。, 試 驗 總 結(jié) ,3,實時熒光定量PCR,實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR) 是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)的進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。,4,RT-PCR 原理,熒光閾值 是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在 熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)

2、置是基線 （背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。, 擴 增 曲 線 ,5,RT-PCR 原理,CT值 是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的 域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)具有重現(xiàn)性。, 擴 增 曲 線 ,6,RT-PCR的數(shù)學(xué)原理,7,CT,8,PCR 反應(yīng)的對照,9,PCR 反應(yīng)條件, 試 驗 總 結(jié) ,10,TaqMan 探針法, 試 驗 總 結(jié) ,11,SYBR Green I熒光染料法,SYBR Green I是一種只與dsDNA小溝 結(jié)合的具有綠色激發(fā)波長熒光染料。, 試 驗 總 結(jié) ,12,SYBR Green I原理, 試 驗 總 結(jié) ,13,兩種方法的比較, 試 驗 總 結(jié) ,14,熒光定量的解析方法,15,PCR 反應(yīng)體系,10PCR Buffer(含Mg2+ ) 2 uL dNTPs(各2.5mmol/L) 2 uL 引物(10umol/L) 各1 uL 模板 2040 ng rTaq DNA聚合酶 0.5 U 加雙或三蒸水至 20 uL, 試 驗 總 結(jié) ,16,絕對定量分析法,根據(jù)起始濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷

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