圣湘生物PCR新技術(shù)簡(jiǎn)介-迪安培訓(xùn).ppt

1、,高精度PCR檢測(cè)肝病毒的現(xiàn)狀及進(jìn)展 湖南圣湘生物科技有限公司 唐國(guó)政,HBV慢性攜帶者（3.5億慢性攜帶者）（分布）百分率, 2% 低分布區(qū),2-7% 中度分布區(qū), 8% 高度分布區(qū),乙肝病毒感染呈全球性分布,中國(guó)是乙肝“大國(guó)”,乙肝是我國(guó)一個(gè)威脅健康的嚴(yán)重問(wèn)題,每年有35萬(wàn)人死于乙肝病毒引起的肝臟疾病 其中18萬(wàn)人死于乙肝病毒引起的肝癌,1.2億乙肝病毒攜帶者,3000萬(wàn)慢性乙肝患者,“十一五”重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃病毒性肝炎重大研究專項(xiàng)啟動(dòng),2009年，我國(guó)病毒性肝炎領(lǐng)域最重要的進(jìn)展是國(guó)家“十一五”重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)啟動(dòng)（見(jiàn)表1）。 這是“十

2、一五”期間與“載人航天與探月工程、大型飛機(jī)”等相平行的16個(gè)重大專項(xiàng)計(jì)劃之一。,表1 、國(guó)家中長(zhǎng)期科技發(fā)展規(guī)劃綱要（20062020年）確定的重大科技專項(xiàng),HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),慢性乙肝的本質(zhì)是由病毒引發(fā)的免疫清除給肝細(xì)胞帶來(lái)的損傷,免疫系統(tǒng),主 題,肝病毒PCR檢測(cè)的臨床需求及現(xiàn)狀 高精度肝病毒PCR檢測(cè)技術(shù)介紹,血清HBV DNA水平是臨床上評(píng)價(jià)HBV復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”,Lok AS, et al. Hepatology. 2009;50:661-662 Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):1

3、00-1-7,慢性乙肝病毒感染的自然史,急性HBV 感染,慢性攜帶者,康復(fù),3050 年,慢性 乙肝,穩(wěn)定,進(jìn)展,肝硬化,代償性肝硬化,肝癌,死亡,失代償肝硬化(死亡）,HBV DNA高載量是肝硬化發(fā)生的重要相關(guān)因素, N=3,774; p value for log-rank test, 0.001,Chen CJ et al JAMA 2006;295:65 Iloeje U et al Gastroenterology 2006,130:678-686,全球權(quán)威指南一致認(rèn)為：乙肝治療的根本目的在于長(zhǎng)期持續(xù)抑制病毒復(fù)制，阻止疾病進(jìn)展,“持續(xù)抑制病毒復(fù)制，減輕肝臟炎癥、壞死，從而延緩和阻斷肝

4、硬化和肝癌的發(fā)生”,抗病毒治療為什么需要長(zhǎng)期？,病毒很難除“根”cccDNA,抗病毒治療只是抑制病毒復(fù)制,停藥后，病毒“復(fù)活”，導(dǎo)致疾病反復(fù)、進(jìn)展,需要長(zhǎng)期抗病毒治療,長(zhǎng)期抗病毒治療帶來(lái)的益處,抑制乙肝病毒復(fù)制，延緩疾病進(jìn)展,提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)存活時(shí)間,調(diào)節(jié)乙肝患者的精神狀態(tài)，減輕心理壓力,減輕家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和家庭成員的負(fù)擔(dān),目前常用的抗病毒藥物:,干擾素 普通干擾素 聚乙二醇干擾素-2a(PEG-IFN-2a) 核苷(酸)類似物 拉米夫定 阿德福韋酯 恩替卡韋 替比夫定等,干擾素治療有哪些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？,干擾素是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力達(dá)到治療目的 優(yōu)點(diǎn)： 療程固定 缺點(diǎn)： 為注射制劑，使用不方便 降

5、病毒能力不強(qiáng) 副作用較大 禁忌癥較多 耐受率低,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,核苷類藥物治療有哪些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？,核苷類藥物直接抑制病毒復(fù)制 優(yōu)點(diǎn)： 降病毒快速、強(qiáng)效 為口服制劑，使用方便 不良反應(yīng)少 缺點(diǎn)： 有耐藥性 療程不確定,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,現(xiàn)有的抗病毒藥物,-干擾素 拉米夫定 阿德福韋酯、聚乙二醇干擾素等,80年代,90年代后期,2005年后,反應(yīng)乙

6、肝病毒載量金標(biāo)準(zhǔn)：乙肝病毒DNA檢測(cè),HBV DNA：乙肝病毒脫氧核糖核酸，可直接了解 體內(nèi)病毒載量和復(fù)制情況；并可用于判斷抗病毒治 療的效果。,2012： HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis, decision to treat and subsequent monitoring of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended bec

7、ause of their sensitivity, specificity, accuracy and broad dynamic range 3841 (A1).,2009： Recently, HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available,乙肝治療指南：美國(guó)和歐洲,Hepatology, 2009 J Hepatol

8、, 2012,HBV DNA載量PCR檢測(cè)的國(guó)際指南,誰(shuí)需要檢測(cè)： HBsAg陽(yáng)性患者和HBsAg陰性的高危人群 攜帶者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者 什么時(shí)候檢測(cè)： 未治療患者、治療前、治療中、結(jié)束治療后均需檢測(cè),HBV DNA載量檢測(cè)在治療優(yōu)化路線圖中的作用,HBV DNA載量檢測(cè)在治療優(yōu)化路線圖中的作用,抗病毒治療前病毒基線的準(zhǔn)確測(cè)定： 適宜抗病毒治療患者選擇、抗病毒治療方案的確定、抗病毒療效的預(yù)測(cè)與后續(xù)療效比對(duì) 抗病毒治療過(guò)程中療效的評(píng)估和方案優(yōu)化、耐藥突變檢測(cè)和治療終點(diǎn)的確認(rèn) 抗病毒優(yōu)化治療停藥后隨訪及復(fù)發(fā)再治的判斷 隱匿性病毒性肝炎的診斷,高精度核酸定量檢測(cè)是保證乙肝患者 走好抗病

9、毒優(yōu)化治療之路的導(dǎo)航系統(tǒng),HBV DNA定量PCR檢測(cè)的國(guó)際指南要求,超敏感（Hypersensitivity） HBV最低檢測(cè)限10-15 IU/ml 寬線性范圍（ wider dynamic range ） 涵蓋101109 IU/ml 高特異性（ High specificity） 可重復(fù)性好（ Repeatability） （操作簡(jiǎn)單，或可自動(dòng)化）,HBV DNA 檢測(cè)臨床應(yīng)用發(fā)展,進(jìn)口HBV DNA PCR試劑性能的比較,我國(guó)某些RT-PCR乙肝試劑盒的靈敏度及線性范圍現(xiàn)狀：,國(guó)產(chǎn)HBV DNA PCR試劑性能現(xiàn)狀,現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)試劑在檢測(cè)靈敏度、線性范圍、可重復(fù)性等方面無(wú)法滿足臨床上日

10、益增加的對(duì)HBV DNA定量準(zhǔn)確性和靈敏度的要求 部分試劑缺乏內(nèi)標(biāo)，影響定量準(zhǔn)確性,中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012,(無(wú)天、無(wú)地、無(wú)標(biāo)、無(wú)法),HBV DNA定量使用低精度試劑的后果,臨床實(shí)踐中影響臨床療效的準(zhǔn)確評(píng)估，從而使病人療效出現(xiàn)偏差 臨床研究中弱化抗病毒療效,主 題,肝病毒PCR檢測(cè)的臨床需求及現(xiàn)狀 超敏感肝病毒PCR檢測(cè)技術(shù)介紹,磁珠法 在樣本中加入超順納米磁珠，富集微量的病毒核酸分子，然后再擴(kuò)增,動(dòng)畫演示,乙肝病毒核酸提取不同技術(shù)比較,磁珠法的性能之一,靈敏度達(dá)到 10 IU/ML 低濃度樣本（10 IU/ml）的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖（重復(fù)90次，檢出率為100%）,線性范圍寬： 20 I

11、U/ml2.00E+09 IU/ml,磁珠法的性能之二,重復(fù)性好，精密度高批內(nèi)(重復(fù)10次測(cè)試) 、批間(重復(fù)30次測(cè)試)Ct值變異系數(shù)（CV）均2%；濃度值對(duì)數(shù)值變異系數(shù)（CV） 8%,磁珠法的性能之三,抗干擾能力強(qiáng)，在高血脂、溶血、黃疸及藥物治療后等異常樣本時(shí)，提高了檢測(cè)的可靠性,磁珠法的性能之四,操作簡(jiǎn)單，過(guò)程溫和，提取快速。與其它方法相比，無(wú)需加熱、無(wú)需高速離心、無(wú)需分離上清液或磁珠顆粒,磁珠法的性能之五,圣湘高精度HBV DNA試劑性能多中心評(píng)測(cè),研究單位 負(fù)責(zé)人 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 譚德明 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院 竇曉光 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 陳金軍,初步報(bào)告，2012,研究方法,50

12、2份慢性乙型肝炎患者的血漿或血清樣本(來(lái)自于三所醫(yī)院的門診和住院病人)，采集的標(biāo)本-20-80低溫冰箱保存，同時(shí)用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan（CAP/CTM）HBV診斷試劑和湖南圣湘生物科技有限公司的磁珠法HBV DNA定量試劑進(jìn)行檢測(cè)。,圣湘磁珠法HBV DNA試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,圣湘磁珠法HBV DNA試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較統(tǒng)計(jì)表 羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性分析： 陽(yáng)性一致性百分比=468/472100%99.2% 陰性一致性百分比= 94/153100%61.4% 總一致性百

13、分比=（468+94）/635100%88.5%,磁珠法HBV DNA檢測(cè)試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測(cè)均有定量結(jié)果的樣本共407例 兩種試劑定量差異: 羅氏：7份； 羅氏圣湘：14份,兩種試劑定量檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖,兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的擬合優(yōu)度情況（相關(guān)分析）,（回歸分析）常數(shù)項(xiàng)和系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果,對(duì)檢測(cè)均為陽(yáng)性的樣本，圣湘磁珠法試劑與羅氏試劑的定量檢測(cè)結(jié)果具有線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.966；回歸方程為：y=0.134+1.005x。,磁珠法HBV DNA檢測(cè)試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,圣湘磁珠法與其它磁珠法病毒核酸提取差異,圣湘生物磁珠法肝病毒試劑盒的性能,國(guó)內(nèi)市

14、場(chǎng),北京佑安醫(yī)院 北京首鋼醫(yī)院 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省傳染病醫(yī)院 石家莊傳染病醫(yī)院 蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 長(zhǎng)征醫(yī)院 上海長(zhǎng)海醫(yī)院 陜西省人民醫(yī)院 山西省人民醫(yī)院,佑安醫(yī)院,鄭大一附院,陜西省人民醫(yī)院,國(guó)內(nèi)市場(chǎng),武漢協(xié)和醫(yī)院 湘雅一、二、三附屬醫(yī)院 廣東省第二人民醫(yī)院 湖南省人民醫(yī)院 湖南省腫瘤醫(yī)院 郴州市第一人民醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 重慶大坪醫(yī)院 超過(guò)300家三級(jí)醫(yī)院,湘雅醫(yī)院,武漢協(xié)和醫(yī)院,廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,社會(huì)價(jià)值,2012年6月25日，人民日?qǐng)?bào)頭版頭條新聞：從“雜交水稻之父”袁隆平到以“高性能炭/炭復(fù)合材料”拿下空缺6年的國(guó)家技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng)的黃伯云，以及榮獲美國(guó)“國(guó)家科技獎(jiǎng)?wù)隆?、擁?6項(xiàng)自主創(chuàng)新專利的戴立忠，一批科技領(lǐng)軍人物在湖南涌現(xiàn)，一批后起之秀在湖南集聚。,核心技術(shù)領(lǐng)軍人物-戴立忠 博士,2010年，中組部部長(zhǎng)李源潮關(guān)心公司發(fā)展,改變，從現(xiàn)在開(kāi)始,解讀基因，擴(kuò)增健康,標(biāo)本類型,血清（2-3ML） 最好是使用EDTA抗凝全血標(biāo)本，抗凝后6h內(nèi)分離血漿。如使用血清標(biāo)本，則需盡