流式細胞術(shù)及其應(yīng)用.ppt

1、流式細胞術(shù)及其應(yīng)用,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 沈文飚 2007.4,生化分析技術(shù)專題,第 一 部 分 流式細胞術(shù)的一般介紹,概念,流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） 利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單 細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特 定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)。 流式細胞儀（Flow Cytometer) 集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算 機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的 一種新型高科技儀器。,流式細胞儀特點,單細胞懸液或生物顆粒,分析速度高,多參數(shù),精度高,當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù),流式細胞發(fā)展史,1930年，Cas

2、persson 和Thorell開始致力于細胞的計數(shù)。 1934年，Moldaven 是世界上最早設(shè)想使細胞檢測自動化的人，他試圖用光電儀 記錄流過一根毛細管的細胞。 1953年，Croslannd-Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計紅細胞光學(xué)自動數(shù)器。 同年，Parker 和Horst 描述一種全血細胞計數(shù)器裝置，成為流式細胞儀的雛形。 1965年，Kamemtsky等提出兩個設(shè)想，一是用分光光度計定量細胞成分；二是結(jié)合測量值對細胞分類。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基礎(chǔ)上提出細胞分選的方法。,流式細胞發(fā)展史,1969年，Van Dil

3、la，F(xiàn)ulwyler及其同事們在Los Alamos，NM（即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs）發(fā)明第一臺熒光檢測細胞計。 1972年，Herzenberg 研制出一個細胞分選器的改進型，能夠檢測出經(jīng)過熒光標(biāo)記抗體染色的細胞的較弱的熒光信號。 1973年，BD公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細胞儀FACS I。 從此，大量的廠家不斷研制生產(chǎn)出自己的流式細胞儀，流式細胞術(shù)進入了一個空前飛速發(fā)展的時代。進入九十年代，流式細胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)已經(jīng)日臻完善，而隨之而來的就是應(yīng)用領(lǐng)域的日趨廣泛。而今，流式細胞儀已經(jīng)深入到

4、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等的各個分支領(lǐng)域，并將在未來為我們的科學(xué)研究發(fā)揮更大的作用。,流式細胞儀及其工作原理,FACSCalibur,特點： 光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定 自動化程度高 操作簡便 使用壽命長 配備1-2根激光 主要用于細胞分析,臨床型（臺式機）,BD LSR,特點： 配置三種激光器488/UV/633 最多可檢測六種熒光和兩個側(cè)向參數(shù) 可與下面FACS Vantage 連用.高效分選細胞,FACS Vantage DiVa,科研型（大型機） BD Biosciences,特點： 多數(shù)字化 適用用各類細胞分選 4路分選 分選10,000cells/second or more,FACSAria,

5、科研型,特點： 分辨率高 選配多種波長和類型激光器 可把感興趣細胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板） 適用于高速分選和多色分析,本校FACSCalibur,流式細胞儀檢測范圍,細胞大小 細胞粒度 細胞表面面積 核漿比例 DNA含量與細胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量,細胞結(jié)構(gòu),特異性抗原 （細胞表面/胞漿/核） 細胞內(nèi)細胞因子 細胞活性 酶活性 激素結(jié)合位點 細胞受體,細胞功能,臨床研究,淋巴細胞亞群測定、血小板分析、網(wǎng)織紅細胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細胞因子測定、AIDS診斷與治療和療效評價、flow-FISH法測定端粒長

6、度,基礎(chǔ)研究,淋巴細胞功能、樹突狀細胞(DC)研究、造血干細胞研究、細胞周期分析、細胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細胞功能研究、多藥耐藥基因研究(MDR)、腫瘤相關(guān)基因表達研究、RNA測定、DNA測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達產(chǎn)物測定、血管內(nèi)皮細胞研究,流式細胞儀的工作原理,光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng) 液流系統(tǒng) 流動室 液流驅(qū)動系統(tǒng) 電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細胞分選系統(tǒng),激光光源,單波長、高強度、高穩(wěn)定性 多采用氬離子激光器或氦氖激光器 一般選配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多檢測13個熒光參數(shù),氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光5

7、14nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以633nm較強。 免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。,光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）,熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光一般由光電倍增管（PMT）檢測。 PMT的響應(yīng)時間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在

8、200900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。 光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。,FACSCalibur 光路圖,液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng),流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作，是液流系統(tǒng)的心臟。 樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出； 鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。,液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱,為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。,細胞分選系統(tǒng),細胞分選系統(tǒng),樣品分選原理 流式細胞儀的分選功能是由

9、細胞分選器來完成的?？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。 穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。 一般液滴間距約距約數(shù)百m。實驗經(jīng)驗公式f = v / 4.5 d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。 使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選 150V，或-1

10、50V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，,不同分選系統(tǒng),信號檢測,液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射后,我們可以接收到兩種光信號. 第一種 散射光 受到激光照射會向立體角為2的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān). 第二種 熒光 熒光染料在激光的激發(fā)下,發(fā)熒光可顯示出研究對象的相關(guān)信息.熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射

11、激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。,在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量 FSC forward scatter light (“fsc”) or forward angle light scatter (“fals”). 小角散射又稱前向角散射光光它反應(yīng)細胞的相對大小和截面積的大小,一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系 ； SSC side scatter light (“ssc”) or 90 light sca

12、tter. 側(cè)向角散射又稱90度角散射光代表細胞的顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化.,全血細胞流式FSC-SSC圖,紅細胞,白細胞,血小板及死細胞,單核細胞,信號檢測-熒光信號,熒光及發(fā)光原理,熒光的產(chǎn)生 一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。 熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。 可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒

13、光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。 壽命為10-8 10 -11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf 為106109s-1。,熒光物質(zhì) 熒光色素 許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有： 異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490 495nm，最大發(fā)射光波長520 530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體

14、型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是：人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色熒光。,其他熒光物質(zhì) 酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶

15、的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。 鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。,數(shù)據(jù)顯示類型,單參數(shù)直方圖（Histogram）,X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系 Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率,二維等高圖和密度圖,便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計 不同的細胞群可以用不同的顏色標(biāo)記 主要表達方式,光譜交叉,兩色以

16、上熒光分析存在 光譜交叉,熒光補償方法,所有補償調(diào)為“0” 調(diào)節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角” 依單陽群體調(diào)節(jié)熒光補償,抗體使用原則,根據(jù)儀器型號和抗原表達強弱合理選擇熒光抗體 低表達抗原標(biāo)記高S/N（信噪比）熒光素，如PE、APC 使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補償,樣品 培養(yǎng)細胞 新鮮組織 石蠟包埋,單細胞 懸液,標(biāo)記 熒光抗體,檢測,表型測定,細胞分選,流式細胞術(shù)操作流程,統(tǒng)計學(xué) 分析,繼續(xù) 培養(yǎng),第 二 部 分 流式細胞術(shù)的應(yīng)用,細 胞 周 期 分 析,樣品制備,1000rpm 5分鐘 收集2X106個細胞,PBS漂洗 兩次,70%酒精 4度固定過夜,收集固定的細胞,PB

17、S漂洗,0.5 PBS 懸浮細胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小時,過300目細胞篩,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分鐘 離心,兩次,混勻，室溫 靜止5分鐘,上機,建立獲取模式，獲取數(shù)據(jù) （PI單染分析細胞周期，同時看凋亡）,去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用,數(shù)據(jù)分析,圈門去除細胞碎片，分析細胞凋亡,圈門去除粘連體，分析細胞周期,細胞凋亡分析,H2O2誘導(dǎo)成神經(jīng)瘤細胞的凋亡照片，藍色為細胞核，綠色是凋亡細胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University,細胞凋亡,細胞凋亡 首先

18、出現(xiàn)的是染色質(zhì)的濃縮, 導(dǎo)致致密的、分離的、邊界清晰的半月形的染色質(zhì)顆粒集中于核膜邊緣; 隨后染色質(zhì)濃縮過程伴隨有核膜及細胞膜的內(nèi)陷, 接著核碎裂成分離的片段, 胞漿濃縮, 細胞支架斷裂,這些片段被細胞膜包裹; 跟著出現(xiàn)的是凋亡細胞斷裂成若干個有完整包膜包裹的凋亡小體(apoptosis body) , 小體的大小及其內(nèi)容差異甚大, 大部分含有若干核片段, 少數(shù)可能沒有核片段。,細胞核染色體局部凝聚,細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻染色體局部凝聚,引自 ,缺乏IL3誘導(dǎo)的細胞凋亡,Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002)

19、 73 80,Annexin V-PE/7-AAD 雙染色法,雙陰：活細胞 Annexin V-PE單陽：早期凋亡細胞 雙陽：晚期凋亡細胞 7-AADd單陽：壞死細胞,檢測淋巴細胞引起的細胞毒作用,細胞毒性淋巴細胞（包括細胞毒性T細胞CTL和自然殺傷細胞NKC）能釋放包含穿孔素蛋白和顆粒酶的顆?；蛲ㄟ^Fas-Fas連接作用于靶細胞，引起靶細胞內(nèi)Caspase酶激增，導(dǎo)致細胞死亡包括凋亡。具有重大研究和應(yīng)用價值。 通常測定淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用，用同位素51Cr，操作復(fù)雜危險而且不利于單細胞分析。 流式細胞術(shù)測定細胞毒作用(FCC)，利用Caspase專一性熒光底物測定受害細胞的細胞毒作用強

20、度。準(zhǔn)確簡便迅速。,The FCC assay provides rapid and sensitive detection of NK cell cytotoxicity. TFL2-labeled Jurkat cells were incubated with the NK cell line NK92 at an E/T ratio of 51 for the time indicated in the presence of the caspase 6 substrate. Significant cytotoxicity(50%) was detected as early as

21、20 min.,From: Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed. Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJ,The detection of NK92-mediated killing of breast carcinoma target cell lineMDA-MB-468 cells using both flow cytometry (A,B) and confocal microscopy (

22、C,D).Target cells were labeled with TFL2 and incubated without (A,C) or with (B,D) NK92cells for 2 h in the presence of caspase 6 substrate. Nonapoptotic target cells are red; apoptotic target cells have both red and green fluorescence signalsand therefore appear yellow.,參考資料,部分書籍及雜志： Methods in Molecular Bology : Flow Cytometry ProtocolsEdited by M J Jaroszeskl and R Heller 63 Humana Press Inc , Totowa, NJ Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Haw