組織DNA提取原理和步驟 詳細(xì)

1、，組織dna提取，tissue dna extraction，實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從生物組織中提取dna，為研究dna的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能打下基礎(chǔ)。dna提取的一般原則：確保一核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。2其他生物大分子(如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪分子)的污染必須最小化。3核酸樣品中不應(yīng)有抑制酶的有機(jī)溶劑和高濃度金屬離子。其他核酸分子，例如4 rna，也應(yīng)該盡量去除。、濃度情感，(a值為1時(shí)50g/ml雙鏈dna，40g/ml單鏈dna或rna，20g/ml單鏈寡聚核苷酸)，各種堿的紫外線吸收光譜，2)適用于熒光分光光度法低濃度核酸溶液的定量分析。(1-5ng)，eb和dna的結(jié)合，從500l全血中提取的基因組

2、dna電泳，從動(dòng)物組織中提取基因組dna，確認(rèn)純度，紫外線分光光度法：如果260nm和a260低于值，就可以知道制劑中仍有蛋白質(zhì)成分。高于此值表示存在rna剩馀量。純r(jià)na a260和a280的比率必須為2.0。a260/a280比是純度檢查的重要指標(biāo)。完整性確認(rèn)(integrity identification)，凝膠電泳法：基因組dna電泳，在電場(chǎng)中游泳緩慢，分解發(fā)生的話，電泳也可能發(fā)生脫發(fā)現(xiàn)象?？俽na電泳觀察每個(gè)帶的含量，告訴我們是否有rna降解。如果額外的槽有帶狀，則可能是dna污染。核酸的儲(chǔ)存dna保存，1)短期保存：4或-20保存在te(tris和edta)緩沖液中。te緩沖液的

3、ph與dna儲(chǔ)存有關(guān)，ph為8可以減少dna脫氨反應(yīng)，ph低于7.0時(shí)dna容易變性。2)長(zhǎng)期存儲(chǔ)：te緩沖液中-存儲(chǔ)70年；在dna溶液中添加一滴氯仿可以有效地防止細(xì)菌和核酸的污染。每個(gè)組織的ml分解液組織菌機(jī)，勻漿2.0ml均質(zhì)，等體積苯酚-氯仿，搖勻5min，2，500rpm 10min，水?dāng)z取量，等體積氯仿-異丙醇，搖勻5min，2，500rpm如果a260nm/a280nm等于1.6，則表明有蛋白質(zhì)或苯酚污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。定量，dna濃度(g/ml)=a260nm 50稀釋倍數(shù)1/光光*1od值等于50g/ml dsdna、40g/ml ssdna或rna，2og/ml升高核苷酸。

4、濃度計(jì)算，1 .分解液： 10 mmol/l ph 8.0 tris-hcl 1 mmol/l edta 0.1mol/l nacl 1% sds er聚合細(xì)胞中核蛋白降解；蛋白質(zhì)和復(fù)合物的形成，2 .酚-氯仿(phenol-chloroform):酚：強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑氯仿：蛋白質(zhì)變性劑，不與水互溶，可與酚相互溶解，拿走剩下的酚。，為什么苯酚要嚴(yán)重飽和才能用于dna分離？苯酚在空氣中經(jīng)常氧化，形成自由基，可直接用于dna分離，磷酸二酯鍵斷裂，dna分解。要氧化苯酚，必須在高溫下再蒸，去除氧化物，用tris-hcl飽和苯酚中性調(diào)節(jié)。3 .氯仿-異丙醇：降低分子表面張力，減少萃取過(guò)程中泡沫的生成，異

5、丙醇幫助分相，保持離心后的上層水、中間層改性蛋白質(zhì)、下層有機(jī)溶劑穩(wěn)定。4。冰無(wú)水乙醇(absolute ethonal)和70%乙醇(70% ethonal):無(wú)水乙醇奪走dna周圍的水分子，使dna失去水分，容易聚合?？梢匀コ龤埩粑锏穆确?。70%乙醇洗滌去除殘留的鹽離子，鹽離子的存在不容易溶解，抑制酶反應(yīng)。5 .te緩沖(te buffer):10 mmol/l ph 8.0 tris-hcl 1 mmol/l edta緩沖不會(huì)對(duì)tris-hcl產(chǎn)生金屬離子干擾，從而使edta穩(wěn)定dna的激活。6.20%十二烷基磺酸鈉(sds):抑制dnase活性，7.10mg/ml蛋白酶k(protase

6、 k):蛋白質(zhì)分解，細(xì)胞膜破壞8.10mg/mlrna酶(rnase)dna釋放不完全。離心力的小方面分離不完全。dna降解的原因樣本不新鮮。采集物質(zhì)在舊樣品本身有大量dna酶提取dna的生物活性的原因嗎？提取的基因組dna鹽濃度過(guò)高的基因組dna中乙醇沒(méi)有清除的純基因組dna中，可能有其他抑制因素提取基因組dna，有時(shí)因?yàn)樘砑诱崽堑脑蛱砑佣嗵潜Ｗo(hù)dna長(zhǎng)度，注意事項(xiàng)，1。處死動(dòng)物后，要取出使用的器官，盡快放入液氮中，以免dnase引起dna分解。在純化過(guò)程中，應(yīng)加入核酸酶抑制劑(eg.edta)，防止dna自身分解。2.組織要盡量磨細(xì)。顆粒太大，細(xì)胞不能完全分解，隨后dna會(huì)嚴(yán)重分解。3 .真核細(xì)胞dna分子量很大，機(jī)械張力容易引起dna分子