病原微生物檢測方法ppt課件

1、.,病原微生物檢測方法,.,2,一，生物化學(xué)方法,原理：生化方法檢測病原微生物實際上是測定微生物特異性酶。由于各種微生物所具有的系統(tǒng)不完全相同 ,對許多物質(zhì)的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物來間接檢測該微生物內(nèi)酶的有無 ,從而達到檢測特定微生物的目的。 辛酯酶法：快速檢測沙門氏菌。沙門氏菌能產(chǎn)生辛酯酶,這一性能是除沙門氏菌外的各屬腸桿菌科細菌所不具備的。以4-甲基傘形酮辛酯(MUCAP)為底物,經(jīng)沙門氏菌的辛酯酶降解后,釋放出4-甲基傘形酮(4MU),在紫外燈下觀察其發(fā)出的藍色熒光。,.,3,二，血清免疫學(xué)方法,免疫學(xué)技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),觀察和研究組織細胞、特定

2、抗原(抗體)的定性和定量技術(shù)。為了顯示和觀察這種抗原抗體反應(yīng),需要預(yù)先將某種標(biāo)記物結(jié)合到抗體上,借標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度,在光鏡或電鏡下進行定性、定位或定量研究。 熒光抗體技術(shù) 酶聯(lián)免疫技術(shù),.,4,三，分子生物學(xué)方法,分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展 ,使人們對微生物的認識逐漸從外部結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)向內(nèi)部基因結(jié)構(gòu)特征 ,微生物的檢測也相應(yīng)的從生化、免疫方法轉(zhuǎn)向基因水平的檢測。 核酸雜交法 PCR及其衍生技術(shù) 基于16S rRNA的檢測技術(shù),.,5,四，分子生物學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合的方法,免疫 PCR (immuno polymerase chain reaction , IM PC

3、R) PCR-ELISA,.,6,五，用生物傳感器進行病原微生物的鑒定,生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù)。生物傳感器包含兩部分,即分子識別器件和換能器。 利用大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng),使用集成化SPR 傳感器快速檢測大腸桿菌O157 : H7 ,采用親和素- 生物素系統(tǒng)放大檢測的反應(yīng)信號,并引入復(fù)合抗體作為二次抗體,使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106 cfu/ ml 下降到105 cfu/ ml。,.,7,六，生物芯片,生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形

4、成生物分子點陣,當(dāng)待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。 根據(jù)芯片上探針的分子種類而將之分為：DNA 芯片(即基因芯片) 和蛋白質(zhì)芯片。,.,8,七，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)用于各種疾病特異性蛋白指紋的識別和判斷,可以直接檢測不經(jīng)處理的尿液、血液或細胞裂解液等。人體血清里有成千上萬個蛋白,人一旦發(fā)生了某種疾病,蛋白質(zhì)成分就必然會起變化。 可以分析得出SARS與非SARS 病人血清中的蛋白質(zhì)成分變化。該技術(shù)不是利用單獨的蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷SARS ,而是用5 個蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷,好比刑偵破案

5、中甄別5 個手指的指紋,故此稱為“指紋圖譜”。,.,9,八，LAMP技術(shù),環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loopmediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是近年來發(fā)展出的一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴增技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)，為等溫擴增。且由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物一白色焦磷酸鉀沉淀，擴增產(chǎn)物可不經(jīng)過電泳，通過肉眼觀察或濁度計即可判定結(jié)果。 用于檢測：丙型肝炎病毒(HCV) 、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARSCoV) 、乙腦病毒(JEV) 、甲型流感病毒(AIV) 、 腮腺炎病毒(MV)等。,.,謝謝,.,11,熒光抗體技術(shù),熒

6、光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,把熒光素作為抗原標(biāo)記物,在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。 直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清,經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體,待作用后經(jīng)洗滌,再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。,返回,.,12,酶聯(lián)免疫技術(shù),酶聯(lián)免疫技術(shù)是根據(jù)抗原- 抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理有機結(jié)合,通過酶催化底物進而發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng),使溶液呈現(xiàn)出顏色變化,從而顯示抗原抗體特異性反應(yīng)的存在。 Dot-ELISA法（DIBA法）： Dot-ELISA 以纖維素膜代替常規(guī)ELISA

7、中常用的聚苯乙烯酶標(biāo)板，這種微孔濾膜對樣品吸附量大，且包被牢固，所以樣品用量少，試驗結(jié)果可通過顏色斑點的出現(xiàn)與否和色澤進行判定，不需特殊儀器。,.,13,檢測灰飛虱帶RBSDV的DIBA法,1,NC膜用鉛筆畫出0.5cm正方格,2,單頭灰飛虱加100ul碳酸鹽緩沖液，用牙簽搗碎，取上清2ul加樣，室溫晾干,3,將干燥的NC膜浸入封閉液中，37 ,30min,4,取出NC膜，浸入用封閉液稀釋10000倍的單抗體中，37 ,1.5h,5,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次5min,6,將膜浸入用封閉液稀釋5000倍的酶標(biāo)二抗中， 37 ,1.5h,7,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次

8、5min,8,將膜浸入HRP底物顯色液中， 37 ,30min，顯色后，用自來水沖洗，室溫晾干,返回,.,14,核酸雜交法,原理：是通過標(biāo)記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針，與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Southern 雜交、Northern 雜交等。核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為DNA 探針、cDNA 探針、RNA 探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。,.,15,斑點雜交,被廣泛用于檢測植物或介體帶毒及核酸同源性。如果用于檢測RNA樣品，稱為Northern雜交；如果用于檢測DNA樣品，稱為Southern雜交。操作程序如下：

9、 1,從病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸為雙鏈，通過加熱使其變性。 2,點樣。將病株汁液滴在NC膜上或尼龍膜上。 3,烘烤纖維素膜，使核酸牢固地結(jié)合到纖維膜上。 4,用蛋白和非特異性小分子DNA溶液混合進行預(yù)雜交約2小時，封閉膜上的非特異性位點。 5,用標(biāo)記的核酸探針與膜上樣品在封閉塑料袋中進行雜交過夜，水浴65。洗膜后進行放射自顯影分析。,.,16,斑點雜交,DNA/RNA 樣品,放射自顯影檢測,.,17,Southern Blot,返回,.,18,PCR及其衍生技術(shù),PCR 技術(shù)又稱體外擴增技術(shù),具有高度的靈敏性和良好的特異性。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RT-PCR) 、多重PC

10、R 、巢式PCR 、PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性( PCR-SSCP ) 、RFL P 、RAPD 技術(shù)、熒光定量PCR 等。以PCR 為基礎(chǔ)的DNA測序分析可用于病原菌的鑒定和亞型的區(qū)分,以及同種病原菌不同菌株的區(qū)分。,.,19,1.檢測單頭蚜蟲帶(bydv-gpv)的pcr法,1,病毒核酸樣品制備。取單頭飼毒(GPV)的禾谷縊管蚜加10ulTris-HCl(pH7.4)研磨，加入10ul苯酚和10ul氯仿，再次研磨，12000rpm離心2min,得到約10ul上清液。 2,cDNA合成。取1ul上清液(含GPV)依次加入1ulGPV CP序列引物(1)，2ul 5X MMLV緩沖液， 6ul雙蒸

11、水，混勻，進行80 1min和50 5min反應(yīng)。再加入2ul 10mM dNTPs, 1ul RNase，1ul 100mM DTT， 1.3ul 50mM MgCl2， 2.1ul MMLV.R.Tase，加雙蒸水至反應(yīng)體系為20ul，進行3730min和100 1min反應(yīng)，即得到cDNA。,.,20,1.檢測單頭蚜蟲帶(bydv-gpv)的pcr法,3,PCR。 10ul cDNA中加入5ul 10X PCR緩沖液，2ul 50mM MgCl2 ，0.15ul引物(1)， 0.15ul引物(2)， 2ul 10mM dNTPs，0.5ul Taq聚合酶，加水至20ul。在PCR儀中進行

12、35個94 (45s)- 50(30s) - 72(2min)擴增循環(huán)，程序結(jié)束后，調(diào)至72保持10min，在-20保存擴增產(chǎn)物。 4,擴增產(chǎn)物的電泳分析。取10ulPCR產(chǎn)物在1瓊脂糖凝膠中電泳，0.1EB染色20min，紫外線下檢測，拍照。,.,21,Pcr擴增程序圖,.,22,2.檢測乙肝cccDNA的PCR法,原理：乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA，HBVcccDNA)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制的中間體，是HBV mRNA和前基因組RNA合成的模板。細胞

13、外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子，其兩條鏈均不閉合，其中負鏈較長，約3200個堿基，含有乙肝病毒基因組的全長基因，在其5起始端與3末端之間有一個包含數(shù)個堿基的“缺刻”(nick)；正鏈較短，有較大的“缺口”(gap)，其3末端不固定，故長度是可變的。,.,23,嵌合引物熒光PCR法,JunBin S等在利用Taqman探針進行的熒光定量PCR檢測中設(shè)計了一條特殊的嵌合引物。該引物由兩個片段連接而成，3端是與HBV DNA正鏈DR2區(qū)前的序列互補的A片段，5端的B片段是與HBV基因組沒有同源性的HBV基因組的部分序列。cc

14、cDNA因為正鏈完整，引物與正鏈的特定區(qū)域雜交后，在DNA聚合酶的作用下，引物能夠順利延伸形成一條新生鏈，而HBV DNA的其他形式，如rcDNA，引物的延伸停止于DR2區(qū)。新生鏈形成以后，設(shè)計另一對引物，一個與嵌合性引物的片段B雜交，另一個與正鏈DR2后的序列互補，進行PCR擴增。實時PCR儀通過探針釋放的熒光強度進行cccDNA定量。,返回,.,24,基于16S rRNA的檢測技術(shù),16SrRNA 存在于所有原核生物細胞中,它們相對穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個細胞幾千個拷貝) ,其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計群、屬、種特異性的探針?，F(xiàn)階段各種常見細菌的16S rRNA 基因幾乎全部測序完成,16S rRNA 編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列。,返回,.,25,免疫PCR,該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機結(jié)合起來,它的基本原理是用一段已知DNA 分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應(yīng), PCR 擴增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA 分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR 產(chǎn)物的有無,來判斷待測抗原是否存在。,返回,.,26,PCR-ELISA,P