2.2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)-zy.ppt

1、2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程,動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段：,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、 動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)、 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)、 生產(chǎn)單克隆抗體技術(shù),提問(wèn)：,植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？,植物組織培養(yǎng)技術(shù)、 植物體細(xì)胞雜交技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。,2.2.1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù),一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),概念:就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。,植物組織培養(yǎng),在無(wú)菌和人工控制的條件下,將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工控制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整的植株。,一、動(dòng)

2、物細(xì)胞培養(yǎng),選材：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官，它們細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。,在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,分散成單個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞貼壁： 懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱(chēng)為細(xì)胞貼壁。 要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。 細(xì)胞的接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為細(xì)胞的接觸抑制。,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性：,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),3、有關(guān)概念:,原

3、代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與繁殖10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱(chēng)為傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物機(jī)體組織,單個(gè)細(xì)胞,原代培養(yǎng),稀釋,分裝,傳代培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程：,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),無(wú)限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能 最終培養(yǎng)成生物體,傳代培養(yǎng)一般傳至

4、10代直至50代就不能再分裂了，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)未發(fā)生變化，形成的細(xì)胞群,傳代培養(yǎng)過(guò)程中有個(gè)別細(xì)胞傳至50代以后，由于遺傳物質(zhì)改變，失去控制，成為無(wú)限增殖的不死的癌癥細(xì)胞，形成的細(xì)胞群,1、植物組織培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的嗎？,、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的嗎？,、為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的呢？,、如何將動(dòng)物組織分散成單個(gè)的細(xì)胞呢？,沒(méi)有,是,成塊的組織細(xì)胞靠在一起,彼此限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理。,思考題,、細(xì)胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉嗎？,、既然胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉，那將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞要注意什么問(wèn)

5、題呢？,蛋白質(zhì)和磷脂,能,注意時(shí)間的控制,思考題,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)是什么成份？,胰蛋白酶水解蛋白質(zhì),細(xì)胞間的成份是蛋白質(zhì),、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？,、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)，一般是取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官，請(qǐng)解釋原因？,不能，因?yàn)閮烧叩淖钸mpH不同，而正常組織細(xì)胞的生存環(huán)境與胰蛋白酶的最適pH較接近,胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官分裂、增殖旺盛,思考題,11、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面為何要光滑、無(wú)毒？,12、培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)到什么時(shí)候就不再分裂、增殖？,13、如此時(shí)細(xì)胞數(shù)量并未達(dá)到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？,易于培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，進(jìn)行生長(zhǎng)增殖,當(dāng)貼壁

6、細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞分裂就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制。,將貼滿(mǎn)細(xì)胞壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，然后繼續(xù)增殖。,這樣的過(guò)程叫做傳代培養(yǎng),思考題,14、如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？,15、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞能一直傳代下去嗎？,16、有些為何能一直傳下去？,17、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是為了得到這些細(xì)胞嗎？,上述過(guò)程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是原代培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng),不都能,發(fā)生突變，朝著癌細(xì)胞方向發(fā)展,不全是,思考題,18、人類(lèi)一般保存的是哪類(lèi)細(xì)胞呢？為什么？,保存10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，因?yàn)?050部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能發(fā)生變化，有少部分還發(fā)生突變向癌細(xì)胞方向發(fā)展。細(xì)胞培

7、養(yǎng)耗費(fèi)大量物力、人力、財(cái)力，因此及時(shí)凍存細(xì)胞很有必要，通常情況下，10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞可以冷凍保存，-70可以保存一年，或者保存于液氮中。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用37度水浴快速?gòu)?fù)蘇的方法。,思考題,19、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？,不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體,多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)，思考并討論以下問(wèn)題：,討論,1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì),2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？,充足的營(yíng)養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境,無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境。,1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期

8、更換培養(yǎng)液） 2、營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）,保證細(xì)胞順利的生長(zhǎng)增殖,培養(yǎng)條件：,DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基,常用的動(dòng)物血清主要有胎牛血清和新生牛血清，血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、生長(zhǎng)激素和多種生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、增殖刺激因子(MSA)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(IGFl、IGF2)等。,為什么加血清？,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、促生

9、長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。,與植物培養(yǎng)基相比其特點(diǎn)是：,（1）液體培養(yǎng)基,（2）含有血清、血漿,動(dòng)物體細(xì)胞大都生活在液體的環(huán)境,培養(yǎng)條件：,3、溫度和pH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,培養(yǎng)條件：,1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液） 2、營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞株、細(xì)胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、血清、血漿,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有

10、成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體） 作為基因工程中的受體細(xì)胞 培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以用于檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù),應(yīng)用：,概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 用核移植的方法得到的動(dòng)物稱(chēng)為克隆動(dòng)物,核移植,（難度高）,受體細(xì)胞：M期的卵母細(xì)胞,二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,細(xì)胞

11、質(zhì),細(xì)胞核,細(xì)胞核移植,多莉羊的培育過(guò)程,克隆羊培育過(guò)程,另一頭綿羊的子宮,、動(dòng)物的克隆與植物克隆一樣嗎？,、用動(dòng)物體細(xì)胞進(jìn)行克隆的過(guò)程,其實(shí)際操作過(guò)程是什么？,動(dòng)物克隆過(guò)程的實(shí)際是細(xì)胞核移植,不,思考題,體細(xì)胞核移植的過(guò)程,卵母細(xì)胞去核,體細(xì)胞取核,電刺激使兩細(xì)胞融合,重組細(xì)胞,重組胚胎,新個(gè)體,、在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有利用價(jià)值的動(dòng)物提供的細(xì)胞。,、用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，為什么？,10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變,思考題,3、體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物

12、是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,不是，克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線(xiàn)粒體DNA）來(lái)自受體卵母細(xì)胞,思考題,4.動(dòng)物克隆實(shí)例很多，為何多莉就舉世聞名呢？,在1997年2月英國(guó)羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。實(shí)際上，“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細(xì)胞核移植的全部過(guò)程，但這并不能減低“多莉”的重大意義，因?yàn)樗鞘澜缟系谝焕?jīng)體細(xì)胞核移植出生的動(dòng)物，是克隆技術(shù)領(lǐng)域研究的巨大突破。這一巨大進(jìn)展意味著：在理論上證明了，同植物細(xì)胞一樣，分化了的動(dòng)物細(xì)胞核也具有全能性,思考

13、題,5、對(duì)比多莉羊和課本高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程，找出操作過(guò)程的不同點(diǎn)？,多莉克隆過(guò)程的受體細(xì)胞是去核卵細(xì)胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程的受體細(xì)胞是去核卵母細(xì)胞；多莉克隆過(guò)程是將供體細(xì)胞核注入受體細(xì)胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程是將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞。,6、討論分析上述哪一種措施更科學(xué)？并說(shuō)明理由？,卵母細(xì)胞當(dāng)中的細(xì)胞周期蛋白含量、活性比卵細(xì)胞高，用它作受體更容易成功,將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞，使克隆動(dòng)物更像供體動(dòng)物，操作也方便,思考題,體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,1、加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育,2、保護(hù)瀕危物種，增加存活數(shù)量,3、克隆動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白,4、可以作為異種移植的供體，可

14、以用于組織器官的移植,體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題：,許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。,1細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反。所以，一般來(lái)說(shuō)幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。,2脫分化又稱(chēng)去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過(guò)程。植物的任何一部分，甚至單個(gè)細(xì)胞都具有長(zhǎng)成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細(xì)胞具有發(fā)育成任何組織

15、的能力，然后進(jìn)行再分化，形成完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無(wú)病毒植株等，這就要求植物的組織或細(xì)胞先進(jìn)行脫分化。,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒(méi)有類(lèi)似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過(guò)程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3（1）可以用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，說(shuō)明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。,但同時(shí)需注意，該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,3（2）首先從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵