詳細(xì)介紹抗體的生產(chǎn)制備

1、2016.12.05,抗體的生產(chǎn)制備,7/17/2020,2,特異性抗體的制備與純化技術(shù),多克隆抗體（抗血清） 單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)）,單克隆抗體與多克隆抗體,7/17/2020,3,7/17/2020,4,抗體發(fā)展史,抗體制備技術(shù)主要經(jīng)歷了三代： 第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）； 第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）； 第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體（genetic engineering

2、antibody）。,第一節(jié) 多克隆抗體的制備與純化,7/17/2020,5,克隆（clone）:是指無性繁殖細(xì)胞系，是由單一個祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。 多克隆抗體（polyclonal antibody , pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫細(xì)胞，可刺激多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多個抗原表位的不同抗體。多獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。 單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）:由一個識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價高、少或無交叉反

3、應(yīng)性。,7/17/2020,6,多克隆抗體（抗血清）的制備流程,7/17/2020,7,（一）抗原的制備 （二）免疫動物 （三）免疫血清的收集、分離和保存 （四）抗體的純化 （五）免疫血清的鑒定,（六）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施,7/17/2020,8,（一）抗原的制備,免疫原（immunogen）指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞；抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity） 免疫原天然抗原、人工合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；,免疫原的分類： （一）細(xì)胞性抗原制備： 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血素； 細(xì)菌- 抗菌抗體（動物免疫血清） （二）可溶

4、性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。,7/17/2020,9,細(xì)胞性抗原：主要包括人、動物的細(xì)胞，還有細(xì)菌、螺旋體及寄生蟲等。 如菌體（O）抗原的制備：選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37 培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100 水浴22.5h殺菌并破壞鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億10億個細(xì)菌，加入苯酚（石炭酸）至最終濃度為5，即為O抗原。,1）細(xì)胞性抗原或顆粒性抗原,2）可溶性抗原,7/17/2020,10,可溶性抗原主要包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補(bǔ)體、

5、細(xì)菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類抗原時，首先需將組織和細(xì)胞破碎，然后再從組織和細(xì)胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。 （1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及大血管，在4 水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機(jī)破碎制成組織勻漿。 （2）細(xì)胞破碎：提取細(xì)胞可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復(fù)凍融法、自溶法和酶處理法等。,（3）蛋白提純,7/17/2020,11, 超速離心法：常用密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油； 選擇性沉淀法（鹽析沉淀

6、法）：其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。如選用3350飽和度的硫酸胺收集沉淀物；,7/17/2020,12, 凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質(zhì)分子按大小被分離； 離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離； 親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； 制備電泳技術(shù)。,7/17/2020,13, 其它,聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白 可將抗

7、原所在的電泳條帶（或蛋白點）切下,研磨后直接用以動物免疫。 NC膜結(jié)合蛋白 將含目的分子的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動物免疫。,7/17/2020,14,分離純化方法的比較,（4）純化抗原的鑒定,7/17/2020,15,含量測定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法，一般采用分光光度計測量法； 相對分子量的鑒定：一般采用SDS-PAGE電泳法； 純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。,3）半抗原,7/17/2020,16,半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子質(zhì)量的物質(zhì)，如：多糖、多肽、甾體

8、激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物及其它化學(xué)藥品； 常用載體：蛋白質(zhì)類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys（賴氨酸） 大分子聚合物：如羥甲基纖維素； 半抗原載體連接方法：常用物理法和化學(xué)法。 物理吸附的載體有羥甲基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原； 化學(xué)法則是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上。,7/17/2020,17,某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。,四）免疫佐劑,良好的佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件： 增加抗原的表面積，并改變抗原的

9、活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性； 佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體； 佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫； 具有無毒性或副作用低的特點。,7/17/2020,18,佐劑一般包括以下幾類： 無機(jī)佐劑：如氫氧化鋁、明釩等 生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等； 人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； 油劑：如弗氏完全佐劑、

10、花生油乳劑等； 納米佐劑,1、佐劑的種類,7/17/2020,19,應(yīng)用最多的是弗氏佐劑和細(xì)胞因子佐劑 弗氏佐劑： 不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂 完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗 弗氏佐劑：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 （乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐劑一般不連續(xù)2次使用 細(xì)胞因子佐劑： IL-2 IL-1 IFNr（羊痘病毒干擾素受體） CSF（集落刺激因子）等,7/17/2020,20,增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強(qiáng)的免疫原； 增強(qiáng)機(jī)體對抗原刺激的反應(yīng)性：提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度； 改變抗體類型：使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG

11、型； 引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。,2、 佐劑的免疫生物學(xué)作用,7/17/2020,21,佐劑的作用機(jī)制歸納起來主要有如下幾種： 可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性。 佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。 增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。,3、佐劑的作用機(jī)制,二、動物免疫,7/17/2020,22,選擇動物時應(yīng)考慮以下因素： 抗原來源與動物種屬的關(guān)系。抗原的來源與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源

12、性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。 動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。,（一）免疫動物的選擇,7/17/2020,23,選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 1、免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。,（二）免疫方法,免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用

13、淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時間一般為710天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。,2、免疫途徑與免疫間隔時間,7/17/2020,24,（三）免疫血清的收集,1）采血前測抗體效價 在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從兔耳緣靜脈取23ml血，制備血清，檢測抗體效價。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。 抗血清的效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)

14、生的抗體，可用雙向擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。,7/17/2020,25,放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原（放射性核素標(biāo)記）混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率（用液體閃爍計數(shù)儀測定Ag*Ab或游離Ag*）。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。,7/17/2020,26,雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)

15、生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。瓊脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50l），周圍各孔內(nèi)分別加入50l 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。,2）抗血清的采集,7/17/2020,27,采集：頸動脈放血、心臟采血、靜脈采血

16、分離：室溫自然凝固12h，然后放4冰箱過夜，待血塊收縮后分離血清，有些血清須經(jīng)5630min 使補(bǔ)體滅活。 保存：4保存存放3個月至半年 低溫保存（-70 -20 ）2至3年，忌反復(fù)凍融 真空干燥保存4-5年,注意：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）,7/17/2020,28,（四）、抗體的純化,1、目的：盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分 2、純化方法 1）單價特異性抗血清的純化 單價特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。 去除雜抗體主要方法：親和層析法（將引起交叉反應(yīng)的共同抗原交聯(lián)到Sepharose 4B柱上，把要處理的抗血清通過親和層析柱，共同抗體吸附在柱上，

17、洗脫液則含有特異性抗體）； 吸附法（指將非特異性抗原液與戊二醛制備成固相吸附劑按1：10直接加到免疫血清中去除雜抗體）,2）特異性IgG類抗體的純化,7/17/2020,29,硫酸銨鹽析：先用50%飽和度去除白蛋白，再用2次33%飽和度沉淀免疫球蛋白。 離子交換層析：常用的離子交換劑有DEAE纖維素和QAE纖維素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多種蛋白質(zhì)，但不能吸附IgG. 親和層析法：將純抗原交聯(lián)到Sepharose4B，裝柱后，將抗血清通過親和層析柱，特異性吸附IgG。 凝膠過濾法：分子篩層析,7/17/2020,30,（五）免疫血清的鑒定,1. 效價的測定：顆粒性抗原可采

18、用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗、ELISA等方法。,2. 特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。 3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴(kuò)散試驗、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。 4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA（放射免疫技術(shù)）競爭結(jié)合試驗等。,第二節(jié) 單克隆抗體的制備和應(yīng)用,7/17/2020,31,第二節(jié) 單克隆抗體的

19、制備和應(yīng)用,7/17/2020,32,單克隆抗體的優(yōu)點,單特異性和均一性,無限供應(yīng),用混合的抗原制備出識別一個抗原決定簇的抗體,7/17/2020,33,雜交細(xì)胞（hybrid cell） 在外界某些條件干預(yù)下（如PEG、電穿孔），當(dāng)兩個細(xì)胞緊密地接觸的時候,其細(xì)胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞染色體/基因的單個細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。,7/17/2020,34,雜交瘤細(xì)胞（Hybridomas） 若用一種腫瘤細(xì)胞與另一種體細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）融合，所形成的雜交細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，也具有淋巴細(xì)胞的一些特性。 B淋巴細(xì)胞雜交瘤 骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融

20、合所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。,7/17/2020,35,雜交瘤細(xì)胞,單克隆抗體的制備,7/17/2020,36,7/17/2020,37,抗原制備 免疫動物 骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 細(xì)胞融合 雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng) 雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化 單克隆抗體的鑒定 單克隆抗體的制備,單克隆抗體制備的主要步驟,一、抗 原,7/17/2020,38,細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等，一般具有較強(qiáng)的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射12107個細(xì)胞。,顆粒性抗原：,可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻，進(jìn)行免疫。,可溶性抗原：,7/17/2020

21、,39,B淋巴細(xì)胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，有利于細(xì)胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機(jī)制，使B細(xì)胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應(yīng)用價值。,二、免疫動物,免疫目的：,7/17/2020,40,采用與骨髓瘤供體同一品系的動物 免疫動物品系（脾細(xì)胞供體）和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。,動物的選擇：,動物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),8 12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）,7/17/2020,41,7/17/2020,42,

22、7/17/2020,43,三、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備,骨髓瘤細(xì)胞系的選擇要點：,自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈 所選擇的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與提供免疫脾細(xì)胞的動物 品系相同,對氨基碟呤敏感,與免疫脾細(xì)胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細(xì)胞,7/17/2020,44,飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 小鼠脾細(xì)胞,飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）：,增加細(xì)胞密度，滿足新生的雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密 度的要求 吞噬清除死亡的細(xì)胞 分泌生長刺激因子促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長,飼養(yǎng)細(xì)胞的種類和制備方法：,7/17/2020,45,四、細(xì)胞融合,融合前的準(zhǔn)備工作,準(zhǔn)備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG 準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞 準(zhǔn)備

23、骨髓瘤細(xì)胞 準(zhǔn)備免疫脾細(xì)胞,7/17/2020,46,拉頸處死小鼠 無菌操作取出脾臟 清洗、研磨 收集細(xì)胞 離心洗滌 細(xì)胞計數(shù),脾細(xì)胞的準(zhǔn)備,7/17/2020,47,收集細(xì)胞 離心洗滌 活細(xì)胞計數(shù) 調(diào)整細(xì)胞濃度,骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,細(xì)胞融合,7/17/2020,48,骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞 按一定比例混合1: 10或1: 5 加入促融劑PEG,PEG,7/17/2020,49,在聚乙二醇作用下B淋巴細(xì)胞可與 骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞,7/17/2020,50,五、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng),HAT選擇性培養(yǎng)的原理： 細(xì)胞的DNA生物合成有主要途徑和補(bǔ)償途徑。當(dāng)有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA

24、合成的主要途徑，需通過補(bǔ)償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。,7/17/2020,51,7/17/2020,52,用于雜交瘤融合的骨髓細(xì)胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK ，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又從免疫B細(xì)胞得到HGPRT和TK 的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作

25、用，通過次黃嘌呤的補(bǔ)償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖。,7/17/2020,53,7/17/2020,54,融合后34天后，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的克隆。 融合后第79天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。,細(xì)胞生長情況,六、雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化,7/17/2020,55,雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法,免疫酶技術(shù)間接ELISA 包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體、加底物顯色 陰性對照：骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清 陽性對照：免疫鼠血清 免疫熒光技術(shù),間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細(xì)胞鋪片、 固定細(xì)胞、加待測樣品、加熒光標(biāo)記抗體（或 加酶標(biāo)抗體和顯色底物）、鏡檢 活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)：流式細(xì)

26、胞術(shù)分析,7/17/2020,56,雜交瘤細(xì)胞的克隆化,在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。 克隆化即把培養(yǎng)孔中的細(xì)胞從單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達(dá)到均一性。,克隆化的方法主要有：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法,7/17/2020,57,有限稀釋法,7/17/2020,58,（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。（2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3）調(diào)整細(xì)胞為310個細(xì)胞/ml。（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100l。孵育于37、5%CO2孵箱中 。（5）在第7天換液，以后每23天換液1次。（6）89天可見 細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。（8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。,有限稀釋法克隆,7/17/2020,59,軟瓊脂培養(yǎng)法 以適當(dāng)濃度雜交瘤細(xì)胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集落。,雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選：,7/17/2020,60,7/17/2020,61,免疫球蛋白類別及亞類的鑒定,七、單克隆抗體的鑒定,小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠的不同類型及其亞類的免疫球蛋白Ig），其中以IgG（Ig