雪旺細胞構(gòu)建人工神經(jīng)缺損中的修復作用

1、雪旺細胞構(gòu)建人工神經(jīng)缺損中的修復作用 【摘要】研究雪旺細胞與PLGA構(gòu)成的組織工程化人工神經(jīng)修復大鼠周圍神經(jīng)缺損的效果。方法將雪旺細胞接種在內(nèi)置polyglactin910纖維的PLGA中空管，構(gòu)建成組織工程人工神經(jīng)。將60只SD大鼠隨機分3組，每組20只，建立大鼠坐骨神經(jīng)缺損20mm的動物模型。A組用切下的自體神經(jīng)段原位縫合，B組使用雪旺細胞組織工程人工神經(jīng)進行修復，C組用未接種雪旺細胞的PLGA中空管進行修復。術(shù)后8、12周使用神經(jīng)電生理和組織學觀察分別進行效果評價。結(jié)果在大體觀察、組織學觀察中，B組的恢復表現(xiàn)與A組相近。在神經(jīng)電生理檢測、小腿三頭肌肌肉重量測定、橋接物橫切面神經(jīng)纖維數(shù)量測

2、定的結(jié)果分析中B組略低于A組但明顯高于C組。B組大鼠橋接段遠端辣根過氧化酶示蹤后在脊髓前角可以看到被標記的神經(jīng)元。透射電鏡可見B組橋接物中段大量的再生神經(jīng)纖維。結(jié)論用雪旺細胞和PLGA構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)修復大鼠外周神經(jīng)缺損，可以修復20mm的長段周圍神經(jīng)缺損，并可獲得接近于大鼠自體神經(jīng)修復的效果。 人工神經(jīng)是由支架材料和種子細胞、細胞外基質(zhì)以及誘導和促進生長的因子等幾部分組成的有機統(tǒng)一體，在外周神經(jīng)損傷修復中有重要的研究意義。雪旺細胞(Schwanncell)是其中最重要的種子細胞。經(jīng)培養(yǎng)和純化后的雪旺細胞在支架內(nèi)類似于Bungner帶樣有序分布，并且分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持引導軸突的再生

3、，是提高修復神經(jīng)缺損效果的關(guān)鍵1,2。目前國內(nèi)外多用新生鼠、兔等動物的周圍神經(jīng)原代培養(yǎng)雪旺細胞構(gòu)建人工神經(jīng)。本實驗采用內(nèi)置polyglactin910的聚羥基乙酸-聚乳酸(PLGA)導管制備三維多孔支架，通過接種人胚雪旺細胞，經(jīng)體外誘導培養(yǎng)，構(gòu)建人工神經(jīng)，并橋接于大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，與自體神經(jīng)移植作對照，研究并評估其對大鼠外周神經(jīng)修復的效果。 1材料與方法 1.1主要試劑、材料和儀器 polyglactin910(聚羥基乙酸和聚乳酸共聚物纖維，美國強生公司);PLGA導管(聚乳酸聚羥基乙酸共聚體，中國科學院);抗S-100單克隆抗體(Sigma公司);20%胎牛血清DMEM(Gibaco公司)

4、;鼠尾膠(自制);0.1g/mL鹽酸氯胺酮注射液;2040mg/mL辣根過氧化酶液;DAB-H2O2作用液;3,3-二甲基聯(lián)苯胺(DAB)5mg，0.05mol/LTris-HCL緩沖液(pH值7.6)10mL，H2O2(30%)1l。 引產(chǎn)34個月嬰兒死胎6個;3個月齡SD大鼠32只，體重200250g;SXP-1B手術(shù)顯微鏡;Leica冰凍切片機;LeicaDMIRB圖像分析儀。 1.2組織工程人工神經(jīng)的制備 1.2.1取胎兒外周神經(jīng)，仔細剝離神經(jīng)外膜，剪成0.51mm3小塊，置于3.5cm培養(yǎng)皿中，使用反復植塊法和差速貼壁法獲得純度較高的雪旺細胞懸液，細胞數(shù)量約在5104。 1.2.2將

5、鼠尾膠包埋polyglactin910纖維(直徑12m，長度2cm)，置入培養(yǎng)皿中，每1012根纖維中心相互重疊呈放射狀排列。使用直接植塊法將人胚雪旺細胞接種于polyglactin910纖維上。20%胎牛血清DMEM，37、5%CO2培養(yǎng)，備用。 1.2.3將20mm長度的PLGA導管預涂鼠尾膠后加入雪旺細胞懸液。37、5%CO2培養(yǎng)2周后，移入polyglactin910纖維，構(gòu)建成人工神經(jīng)導管，繼續(xù)培養(yǎng)2d，準備植入。 1.3動物實驗 將60只SD大鼠隨機分3組，每組20只。A組用自體神經(jīng)段原位縫合;B組用組織工程人工神經(jīng)修復;C組用無雪旺細胞的PLGA中空管。腹腔注射氯胺酮200mg/

6、kg麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪洞巾后作股后側(cè)切口，暴露坐骨神經(jīng)，顯微尺測量下切除坐骨神經(jīng)18mm，自然回縮后造成20mm的神經(jīng)缺損。遠側(cè)斷端距腓腸肌邊緣約5mm，用10的帶針縫線在10倍手術(shù)顯微鏡下，將橋接物與兩側(cè)神經(jīng)斷端的外膜縫合。關(guān)閉傷口，按實驗動物標準飼養(yǎng)12周。術(shù)后第8周各組隨機取10只大鼠進行觀察，第12周對各組剩下10只大鼠進行觀察。 1.4統(tǒng)計分析 采用SPSS12.0軟件對實驗中各組數(shù)據(jù)進行分析，P0.05時認為差異有顯著性。 2結(jié)果 2.1一般觀察 術(shù)后觀察傷口愈合情況、大鼠的精神狀態(tài)、步態(tài)以及足部潰瘍情況等。術(shù)后1周傷口基本愈合，各組大鼠均出現(xiàn)明顯跛行。2周時各組大鼠均出現(xiàn)患肢足

7、跟潰瘍。12周時，A、B組大鼠患肢足跟潰瘍基本愈合，但患肢仍跛行;C組患肢足跟潰瘍未愈合，患肢肌肉明顯萎縮。 2.2植入物觀察 第8、12周時，切開傷口進行觀察。發(fā)現(xiàn)各組大鼠取材神經(jīng)干呈乳白色連接遠端神經(jīng)，沒有發(fā)現(xiàn)吻合口的斷裂。A、B組再生神經(jīng)直徑較粗，神經(jīng)近端未見神經(jīng)瘤形成，表面可見清晰的血管，同周圍組織均有黏連，但可以分離。B組PLGA管已基本降解。C組近端增粗，遠段略塌陷，與周圍肌肉組織輕度黏連，PLGA導管幾乎完全降解吸收，神經(jīng)沒有長入遠端。 2.3神經(jīng)電生理檢測 采用EsaoteBiomedicaPhasis肌電測定系統(tǒng)，輸出電刺激為單脈沖方波，電壓25V，時間0.010.02ms。

8、用2個雙極保護電極作為刺激電極分別作用于橋接段的近側(cè)端和遠側(cè)端，以圓心針單極電極插入腓腸肌肌腹中部，記錄再生神經(jīng)混合傳導速度(m/s)、復合動作電位峰值(mV)。術(shù)后第8、12周，A、B組都有神經(jīng)傳導通過，在吻合口的遠端都可以記錄到肌電圖，肌電圖測量2組傳導速度和動作電位的振幅都較對側(cè)正常神經(jīng)有所下降。C組不能引出神經(jīng)再生的動作電位，只有大量的失神經(jīng)電位。術(shù)后第8、12周各組電生理檢測的結(jié)果分別列在表1、2，與A組相比，B組神經(jīng)傳導速度較慢，復合動作電位的峰值較低，兩組間的差別有顯著性(P0.05)表1術(shù)后第8周各組動物電生理檢測 2.4辣根過氧化酶示蹤 術(shù)后12周，再次手術(shù)暴露出坐骨神經(jīng)和人

9、工神經(jīng)移植段，在人工神經(jīng)橋接段的遠端1cm的神經(jīng)干內(nèi)注射30%的游離辣根過氧化酶液1l，繼續(xù)飼養(yǎng)48h后，在深度麻醉下經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定，取出L4、5脊髓，做冰凍切片，片厚40m，用TMB(3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺)呈色，中性紅復染，光鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)和脊髓前角神經(jīng)元，在同側(cè)脊髓前角可以看到HRP標記的呈棕色的神經(jīng)元(圖1)。 2.5小腿三頭肌肌肉測量 術(shù)后第8、12周取大鼠術(shù)側(cè)小腿三頭肌，吸取血跡，在分析天平上稱肌肉重量。各組大鼠小腿三頭肌肌肉較健側(cè)明顯萎縮，平均肌肉重量A組高于B組，B組高于C組，且差異有顯著性(P0.05)(表3)。表3術(shù)后各組大鼠小腿三頭肌重量的比 2.

10、6組織學觀察 術(shù)后第8、12周，在顯微鏡下取出橋接物。分別選擇近側(cè)吻合口段、橋接體中段、遠側(cè)吻合口段取材，橫向連續(xù)切片，作HE染色和甲苯胺蘭染色，光鏡下觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。普通光鏡下，近端吻合口各組均有再生神經(jīng)纖維通過，A組再生神經(jīng)纖維排列致密，髓鞘清晰可見;B組再生神經(jīng)排列較為整齊，呈束狀，可見豐富的新生血管穿插于其間;C組再生神經(jīng)纖維較為雜亂，有較多的纖維組織增生。在橋接體中段，A組再生神經(jīng)排列整齊;B組再生神經(jīng)束較稀疏，但未見瘢痕形成或淋巴細胞侵潤;C組再生神經(jīng)纖維雜亂無章在遠端吻合口，A、B2組仍有較多的再生神經(jīng)纖維通過(圖2);C組則沒有。B、C2組近、中、遠三段均未見有po

11、lyglactin910纖維殘留。 2.7圖像分析 將術(shù)后12周各組甲苯胺蘭染色切片(圖3)置于圖像分析儀的顯微鏡下，采用LeicaQWin2.8圖像分析系統(tǒng)，對橋接體中段進行測量分析，統(tǒng)計中段的再生神經(jīng)纖維數(shù)目、再生神經(jīng)束面積及神經(jīng)纖維密度列于(表4)。 圖像分析顯示B組再生神經(jīng)中段在再生神經(jīng)纖維數(shù)目與神經(jīng)纖維密度兩方面計數(shù)均少于A組，差別有顯著性(P0.05)。C組在再生神經(jīng)纖維數(shù)目與再生神經(jīng)束面積兩方面均明顯低于A、B2組，差別有顯著性(P0.05)。這與光鏡下HE染色切片觀察到神經(jīng)再生情況相吻合。表4術(shù)后12周各組橋接物中段橫切面圖像分析 2.8透射電鏡觀察 術(shù)后12周，取移植中段再生

12、神經(jīng)，D?Hanks液洗滌，2%戊二醛固定2h，4下D?Hanks液洗滌2次，1%鋨酸固定2h，乙醇逐級脫水，618環(huán)氧樹脂包埋，LKB-V超薄切片機切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，用PhilipsCM120透射電鏡拍片，觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。術(shù)后第12周，B組橋接物中段可見大量的再生神經(jīng)纖維，髓鞘形成良好(圖4)。 3討論 Aguayo等1979年首先將體外培養(yǎng)的乳鼠雪旺細胞種植到5mm長的血管段中，用于橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，6周后發(fā)現(xiàn)有大量再生神經(jīng)纖維，為組織工程人工神經(jīng)的研究奠定了基礎。 xx年Evans等3用左旋聚乳酸導管種植同種異體的雪旺細胞修復大鼠12mm神經(jīng)缺損，2、4個月

13、時檢測神經(jīng)修復的各項指標和同源雪旺細胞移植療效相當，但是比自體神經(jīng)移植效果略差。同年Mosahebi等4用聚羥基丁酸戊酯導管種植同種異體雪旺細胞，發(fā)現(xiàn)在6周時同種異體雪旺細胞受到排斥，但神經(jīng)軸突的長入情況與同源細胞移植相似，并且沒有導致有害的免疫反應。國內(nèi)，xx年程飚5將成年兔雪旺細胞種植在醫(yī)用生物膜和polyglactin910纖維上，橋接2.5cm長坐骨神經(jīng)缺損，表現(xiàn)出與自體神經(jīng)移植相當?shù)寞熜?。xx年顧曉松等6用殼聚糖套管和聚乙醇酸纖維制成人工組織神經(jīng)移植物，輔加促神經(jīng)生長的中藥有效組分，成功修復大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損。 雖然大量動物實驗顯示用神經(jīng)導管能有效修復短距離神經(jīng)缺損7，但目前還

14、沒有一種能夠在臨床上代替自體神經(jīng)移植。受神經(jīng)趨化和接觸引導的限制，人工神經(jīng)橋接的距離一般不超過30mm，而臨床上面臨的主要問題是長段缺損時自體神經(jīng)的不足8。 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，增強人工神經(jīng)所負載的雪旺細胞的功能，有希望增加橋接的距離。1998年Menei等9發(fā)現(xiàn)經(jīng)基因改良能分泌人BDNF的雪旺細胞可促進大鼠神經(jīng)的軸突再生。馮世慶等10用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含NGF和BDNF表達基因的質(zhì)粒導入雪旺細胞，4周后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達明顯增加。電鏡下可見到轉(zhuǎn)染后的雪旺細胞內(nèi)含豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。陳禮剛等11證實轉(zhuǎn)有pSVPoMcat微基因的雪旺細胞能穩(wěn)定分泌21.5KuMBP。Joung12等用腺病毒轉(zhuǎn)染

15、lacz基因到雪旺細胞上，基因持續(xù)表達5周以上。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應用，要充分考慮到可能產(chǎn)生的不良后果。 國內(nèi)張琪13等曾將成人副神經(jīng)埋于裸鼠皮下模擬瓦氏變性處理，體外培養(yǎng)成功獲得人雪旺細胞。另一方面利用大鼠自體雪旺細胞構(gòu)建人工神經(jīng)的實驗14也得到成功。本實驗采用引產(chǎn)死胎外周神經(jīng)作為雪旺細胞。34個月胎齡時，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚不充分，髓鞘尚未成熟，接種后雪旺細胞量大且容易生長。且胚胎神經(jīng)材料與成人神經(jīng)相比，所含結(jié)締組織成分較少，神經(jīng)外膜更易剝離。 本實驗中將polyglactin910纖維植入PLGA可降解導管中，構(gòu)建雪旺細胞的三維生長空間，有利于細胞和周圍物質(zhì)之間的交換，促進其分裂增殖。在評估神經(jīng)

16、再生情況時，除使用電生理方法外，同時通過活體肢體功能觀察、靶器官肌肉測量以及辣根過氧化物酶示蹤來綜合判斷損傷神經(jīng)修復后靶器官的功能恢復情況。這樣評估能較全面的對電生理的結(jié)果進行補充支持，避免僅用電生理評估造成的偏差。 受損神經(jīng)修復再生時，許多小軸突常常在通過吻合口后就中止于微神經(jīng)瘤，這就會使再生神經(jīng)橫斷面圖像分析的結(jié)果與實際功能的恢復程度不一致。本實驗分別選擇近側(cè)吻合口段、橋接體中段、遠側(cè)吻合口段取材，切片染色后，光鏡下觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況。并對再生神經(jīng)的纖維數(shù)目、再生神經(jīng)束面積以及有髓神經(jīng)纖維密度進行統(tǒng)計學分析，能較全面的評價神經(jīng)再生的效果。 從本實驗結(jié)果可以看出：在修復大鼠外周神經(jīng)缺損中，人胚雪旺細胞人工神經(jīng)的修復效果與大鼠自體神經(jīng)移植相近，且明顯高于空白管對照組。從近端切口往離心方向，距離越遠神經(jīng)修復程度越低，可能是近端切口軸漿運輸分泌神經(jīng)生長因子的關(guān)系。使用人胚雪旺細胞修復大鼠周圍神經(jīng)缺損可以獲得接近于大鼠自體神經(jīng)移植的效果，表明人雪旺細胞可以引導大鼠神經(jīng)細胞，并且分泌的生長因子對大鼠神經(jīng)細胞具有一定作用?？梢栽O想，在修復人體周圍神經(jīng)缺損時，人胚雪旺細胞人工神經(jīng)可能發(fā)揮更好的修復效果。 回顧整個實驗，通過活體肢體功能觀察、靶器官肌肉測量、電生理