藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析.ppt

1、II -免疫分析法Immunoassays,國際抗體藥物,2009年美國市場上的抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷售額最大的類別。 2010年美國市場的單抗藥物銷售額為185億美元 2011年，全球單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到628億美元， 世界范圍內(nèi)的單抗藥物銷份額約是整個(gè)生物制藥市場份額的36%。,國內(nèi)抗體藥物,目前我國的上市抗體品種中,國外進(jìn)口單抗占據(jù)多數(shù) 2011年國內(nèi)市場規(guī)模超過10億元 我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素： 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個(gè)國家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的核心競爭點(diǎn) 抗體下游純化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩 QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）理念的應(yīng)用,Antibo

2、dy and structure,特點(diǎn)：2個(gè)基因決定一個(gè)蛋白質(zhì) 與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，高度專一性,抗原和抗原決定簇,一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定簇 每個(gè) 抗原決定簇至少誘生一種專一性抗體 蛋白質(zhì)抗原的決定簇含有六個(gè)以上氨基酸,。,克隆選擇學(xué)說,單抗和多抗,多克隆抗體（polyclonal antibody）指由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的針對多種抗原決定簇的多種抗體混合物，如免疫血清。 單克隆抗體（ monoclonal antibody）指由一種 B 細(xì)胞生產(chǎn)，針對某一抗原決定簇的單一抗體。,Preparation of polyclonal antibodies,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,混合抗體,

3、1,2,3,4,免疫前要先把抗原作成乳劑,約在兩月內(nèi) 注射五到八次,Preparation of monoclonal antibodies,Preparation of recombinant antibodies,淋巴細(xì)胞,總RNA,抗體輕、重鏈文庫,重組單鏈抗體基因,輕、重單鏈基因,大腸桿菌表達(dá)體系,單鏈抗體,單鏈抗體,在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽，連成一條單鏈 如果僅是兩條鏈的可變區(qū)，稱為ScFv 連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是GGGGS3,Ab as antigen- Primary and second

4、ary antibody,Primary Ab,Secondary Ab,Primary Ab,Protein A,二抗針對一抗的物種特異性,Protein A針對所有動(dòng)物抗體Fc,Immunoassays,The most important biological assays for: Identification of proteins and small bio-molecules Quantification for complex biological sample without separation Powerful separation High sensitivity, s

5、pecificity and accuracy,抗體的標(biāo)記方法,放射性同位素標(biāo)記 酶標(biāo)記 熒光標(biāo)記 有機(jī)分子熒光標(biāo)記 綠色熒光蛋白標(biāo)記 稀土熒光標(biāo)記 通用標(biāo)記,放射性碘標(biāo)記,HRP酶標(biāo)記,簡單化學(xué)偶聯(lián)方法： 1過碘酸鈉法：僅用于HRP的標(biāo)記。HRP是一種糖蛋白，過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，再與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)后，再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后，形成穩(wěn)定的HRPCH2NHIgG酶標(biāo)記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，常在標(biāo)記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上的和氨基。 2戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法：戊二醛具有兩個(gè)活性醛基，分別與酶分子和抗體分子上的氨基

6、結(jié)合。,NaHB4,HRP,Labeling with isoFITC,GFP labeling,GFP gene,ScFv gene,expression,GFP gene,Protein A gene,expression,Ab-Fc,通用標(biāo)記,+,Avidin/streptA,+,Anti-digoxin Ab,2nd Ab,Protein A,Primary Ab,Primary Ab,Important assays,Immunostaining Western blot Fluorescent microscopy Quantification of immunostaining

7、Quantitative assays: Radioimmunoassay, RIAcompetent binding Fluorescence immunoassay, FIA FPIA-homogeneous assay TRFIA Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,Immunostaining,Fluorescence/luminescence,Colorization,or,組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞單層,細(xì)胞/組織固定,免疫染色,（熒光）顯微鏡觀察,免疫熒光標(biāo)記的c-Myc,phalloidin熒光標(biāo)記的微絲,熒光染色的細(xì)胞核,合成圖像,Imm

8、unoblot - Western Blot,Electroblotting,gel,PVDF membrane,Immunostaining,封閉,分析 抗體,顯色抗體,顯色,數(shù)字化灰度 圖像分析,0.5 1 2 4 6 8 12 16 24 30 (h),c-myc,p53,Cyclin D1,Actin,CaN,CaM:La3+,HRP,StreptAvidin,Biotin,RIA Assay,免疫競爭結(jié)合分析-小分子抗原分析的基本方法,Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag,*AgAb: Precipitant,放射性計(jì)數(shù),常用分離沉淀技術(shù),鹽析

9、法：飽和硫酸銨、硫酸鈉 聚乙二醇法（w=6000） 特點(diǎn)： 快速，價(jià)廉，來源方便，受環(huán)境影響大 抗體免疫沉淀法 特點(diǎn)： 分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但成本高 固相吸附劑,RIA測量步驟,恒量的* Ag、Ab加入反應(yīng)管中 加入待測樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度） 37或4 溫育 加入分離劑分離結(jié)合及游離部分 測定以總放射性為分母，測定* AgAb 為分子，計(jì)算結(jié)合%，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 待測樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度,Calibration curve,ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）,Sandwich EL

10、ISA,競爭法（略）,High Convenience High Sensitivity,96-well plate,包被,封閉,結(jié)合,顯色,酶標(biāo)儀測定,hv,洗滌,洗滌,洗滌,終止,酶的底物,HRP的底物,氧化產(chǎn)物(橙紅色),492nm吸收,2mol/L硫酸終止反應(yīng),AP的底物 硝基苯磷酸酯 對硝基酚(黃色) NaOH終止反應(yīng) 405nm吸收峰,磷酸4-甲基傘酮 （熒光底物）,熒光偏振免疫分析,Principle of fluorescence polarization,emitting dipole,absorbing dipole,excitation light polarized a

11、long z,x,z,y,I,I,detector,Fluorescence polarization immunoassay,Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag,High polarized fluorescence,Low polarized fluorescence,偏振度r,時(shí)間分辨熒光免疫分析,熒光背景和常用探針分子的熒光壽命,Lanthanide labeling,Lanthanide labeling,Ligand labeling,CTTA,BCPDA,鑭系熒光底物法,DELFIA法,熒光試劑標(biāo)記可以消除環(huán)境中稀土污染造成的熒光背景,固

12、相時(shí)間分辨熒光,分子印跡和核酸適配體,思考題,什么是抗體？其結(jié)構(gòu)特征是什么？怎么由基因編碼一個(gè)抗體？ 什么是抗原決定簇？一個(gè)抗原分子是否只有一個(gè)抗原決定簇？ 抗體與抗原結(jié)合的特異性如何？為何有如此高的特異性？ 抗體有哪些應(yīng)用？ 什么是抗體的Fab片段和Fc片段？其結(jié)構(gòu)分別是如何？ 什么是單抗和多抗？分別是如何制備的？哪一種抗體的特異性高？為什么？ 什么是抗體庫？ 什么是單鏈抗體？什么是ScFv？如何制備單鏈抗體？單鏈抗體有何應(yīng)用？ 什么是二抗？二抗與一抗如何結(jié)合的？如何選擇使用二抗？ 什么是Protein A？它如何與抗體結(jié)合的？ 什么是免疫分析？免疫分析有哪些特點(diǎn)？有哪些主要類型的免疫分析？ 抗體標(biāo)記有哪些種類和方法？ 有哪幾種通用抗體標(biāo)