第九章胚胎干細(xì)胞

1、第九章胚胎干細(xì)胞，1。干細(xì)胞的概述、基本概念、分化和發(fā)展、干細(xì)胞的分類、干細(xì)胞的特征、胚胎干細(xì)胞的類型、干細(xì)胞，干細(xì)胞是一種具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。包括胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞。干細(xì)胞的發(fā)育受許多內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。(1)基本概念、干細(xì)胞、功能、組織發(fā)生、多能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、組織干細(xì)胞，(2)干細(xì)胞分類、全能干細(xì)胞、具有無限分化潛能的細(xì)胞。它能分化成人體的各種細(xì)胞，構(gòu)成人體的各種組織和器官。八細(xì)胞期，多能干細(xì)胞，具有多種組織潛能的干細(xì)胞，可以分化成一個器官，即可以形成兩種或兩種以上細(xì)胞的干細(xì)胞。它具有自我增殖和分化兩種功能。骨髓造血干細(xì)胞是典型的多能干細(xì)

2、胞。造血干細(xì)胞移植可以治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。多能干細(xì)胞，多能干細(xì)胞進(jìn)一步分化成多能干細(xì)胞，而多能干細(xì)胞只能分化成某種類型的細(xì)胞。也被稱為多能干細(xì)胞。例如，表皮干細(xì)胞只能分化成角質(zhì)細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來源于胚胎干細(xì)胞，如早期胚胎、原始生殖細(xì)胞或畸胎瘤組織，其特征在于在體外穩(wěn)定自我更新、穩(wěn)定維持正常核型、發(fā)育全能和多能性、分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種類型的分化細(xì)胞，甚至參與個體發(fā)育，也稱為多能干細(xì)胞。組織特異性干細(xì)胞是指分布在成體生物組織中并具有構(gòu)建和補(bǔ)充某些組織細(xì)胞功能的干細(xì)胞。也稱為成體干細(xì)胞。(3)干細(xì)胞分化發(fā)育，干細(xì)胞增殖速度普遍較慢。一旦身體需要，干細(xì)胞就可以進(jìn)入分

3、化過程，以滿足組織和器官生長、發(fā)育和修復(fù)的需要。當(dāng)干細(xì)胞進(jìn)入分化階段時，其增殖速度開始逐漸加快。干細(xì)胞的增殖是自我穩(wěn)定的，這意味著干細(xì)胞會自我更新并保持其數(shù)量不變，這是干細(xì)胞區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征。早期胚泡中的未分化細(xì)胞(受精后57天)。胚泡包含大約140個細(xì)胞，中央胚泡腔和腔一側(cè)的內(nèi)部細(xì)胞群，可以發(fā)育成具有全能性的各種組織和器官。當(dāng)內(nèi)部細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，它被稱為胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞繼續(xù)分化形成多能干細(xì)胞。胎兒、兒童和成人組織中的多能干細(xì)胞統(tǒng)稱為成人干細(xì)胞。在特定的外部條件下，一個組織的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”成其他組織的功能細(xì)胞。干細(xì)胞分化成不同的血細(xì)胞。(4)干細(xì)胞的特性，干細(xì)

4、胞具有自我更新和分化的潛能。干細(xì)胞體積小，胞質(zhì)比大，端粒酶活性高，可以無限增殖。干細(xì)胞可以連續(xù)分裂幾代，或者長時間處于靜止?fàn)顟B(tài)。干細(xì)胞有兩種生長方式。對稱分裂，不對稱分裂，兩種生長方式，形成兩個相同的干細(xì)胞。調(diào)節(jié)分化蛋白的不均勻分布，子細(xì)胞不可逆地向分化末端移動，成為功能特異性分化細(xì)胞；留住父母的另一個特點(diǎn)是他們?nèi)匀皇歉杉?xì)胞。(5)胚胎干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、全能胚胎干細(xì)胞和多能胚胎干細(xì)胞的類型。在胚胎發(fā)育的最早階段，每個卵裂球的發(fā)育潛能幾乎相等，每個細(xì)胞可以獨(dú)立產(chǎn)生一個完整的身體；可以誘導(dǎo)分化成幾乎所有類型的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的生物可塑性，這是多能性的，比組織干細(xì)胞稍強(qiáng)。組織來源，胚胎癌細(xì)胞，胚胎癌

5、細(xì)胞，全能胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，多能胚胎干細(xì)胞，胚胎生殖細(xì)胞，2。胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)建立技術(shù)、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法、無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法、胚胎細(xì)胞來源、胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)過程、胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞系的特征和鑒定以及體外建立胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的技術(shù)在小鼠中最為成熟，成功率最高。培養(yǎng)的原理依賴于獲得全能的胚胎細(xì)胞或細(xì)胞簇，并建立適合其體外增殖和抑制分化的培養(yǎng)系統(tǒng)。早期胚胎細(xì)胞易于在體外分化，因此防止其分化并確保其全能性或多能性是關(guān)鍵。分化抑制劑、飼養(yǎng)層、特殊細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、分化抑制因子(DIF)，體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞和胚胎上皮細(xì)胞的兩種主要方法，飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法、無飼養(yǎng)層細(xì)

6、胞培養(yǎng)法和能分泌必需生長因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞通常在原代或初始培養(yǎng)階段需要。通過在含有流式細(xì)胞儀的正常培養(yǎng)基中加入生長因子或某些特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來替代飼養(yǎng)細(xì)胞。(1)飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法，將常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞、MEF細(xì)胞、STO細(xì)胞和來自不同品系小鼠的12dpc胚胎切割并用胰蛋白酶消化，然后將細(xì)胞分離并培養(yǎng)成單層成纖維細(xì)胞。絲裂霉素處理停止細(xì)胞分裂后，用作胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株對硫鳥嘌呤和哇巴因有抗性，主要分泌干細(xì)胞生長因子和白血病抑制因子。用作胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物飼養(yǎng)層的胚胎干細(xì)胞或STO細(xì)胞應(yīng)在37下用10毫克/升絲裂霉素c處理4小時，并在使用前用PBS徹底洗滌。(2

7、)無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法，小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，直接加入重組人生長因子；進(jìn)入胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；水牛大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基；23周齡大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(RHCM)。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無飼養(yǎng)層，23個細(xì)胞條件培養(yǎng)基，12個新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和10%胎牛血清，胚胎干細(xì)胞原代培養(yǎng)和建立初期胚胎干細(xì)胞/胚胎上皮細(xì)胞培養(yǎng)成功率不高，應(yīng)補(bǔ)充適當(dāng)?shù)纳L因子。成功建立后，可以使用無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)方法。不同種類的胚胎干細(xì)胞對生長因子有不同的要求。例如，人胚胎干細(xì)胞不能與白血病抑制因子反應(yīng)，并且很難抑制人胚胎干細(xì)胞的分化。(3)胚胎細(xì)胞的起源、胚胎發(fā)育的速度和方式有很大不同。在小鼠中，通常使用34天胚泡或23天桑

8、椹胚；在豬中，使用810天的胚泡；在綿羊中，使用89天的胚泡；人類和牛使用78天的胚泡。當(dāng)胚胎體外培養(yǎng)至所需發(fā)育階段時，體外授精胚胎或重建胚胎也是胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的有效物質(zhì)來源。通過小鼠超數(shù)排卵收集胚胎。成年雌性小鼠注射5U妊娠馬血清促性腺激素，48小時后注射5U人絨毛膜促性腺激素。雄性大鼠自然關(guān)籠交配，陽性大鼠為0天(即0.5天)；從第三天到第四天中午(3.5 dpc4.5 dpc)，解剖孕鼠子宮，沖出早期囊胚，進(jìn)一步分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞系，可解剖發(fā)育至8.5 dpc10.5 dpc的胚胎，建立小鼠EG細(xì)胞系。人胚胎干細(xì)胞系可通過收集人早期胚胎和性腺，培養(yǎng)新鮮或冷凍的受精卵或卵裂期至囊胚期的人胚

9、胎，進(jìn)一步分離胚胎干細(xì)胞而建立；通過人工流產(chǎn)獲得78天胚泡或59周胚胎的性腺，并分別分離培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞系。(4)胚胎干細(xì)胞和乙二醇細(xì)胞的培養(yǎng)過程，胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)過程，基礎(chǔ)培養(yǎng)基，15% DMEM溶液0.1摩爾/升巰基乙醇50U/毫升青霉素，50ug/毫升鏈霉素，將囊胚接種到鋪有單層甲胎蛋白細(xì)胞作為無有絲分裂活性滋養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，通過免疫外科手術(shù)分離囊胚的細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞，或通過常規(guī)培養(yǎng)分離細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞44.5dpc的小鼠胚泡主要由分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞和未分化的ICM細(xì)胞組成。前者細(xì)胞通常在其表面表達(dá)主要的組織相容性復(fù)合物(MHC)，該復(fù)合物可識別其相應(yīng)的抗體并形成免疫復(fù)合物，該

10、免疫復(fù)合物可導(dǎo)致補(bǔ)體存在時的免疫溶解。具體操作如下：(1)體外培養(yǎng)的囊胚用酸性酪絲溶液(pH2.5)處理，去除透明帶；漢克斯洗滌，加入兔抗JCR小鼠脾細(xì)胞抗血清(抗H2B)；移至含有新鮮豚鼠血清、Hanks溶液的培養(yǎng)基中，然后移至覆蓋有MEF或STO飼養(yǎng)層細(xì)胞和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的96孔板中進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。30分鐘，囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞呈泡狀并免疫溶解；然而，ICM細(xì)胞沒有H2b抗原，是完整的。30分鐘，常規(guī)培養(yǎng)方法，無透明帶囊胚培養(yǎng)34天，貼壁囊胚長出ICM細(xì)胞團(tuán)；胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的混合消化液在37下消化5 min。將解離的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4天。在一些孔中可以看到嵌

11、套的胚胎干細(xì)胞群。胰蛋白酶消化胚胎干細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)、克隆和純化胚胎干細(xì)胞。根據(jù)胚胎干細(xì)胞的巢密度，將其轉(zhuǎn)移到大容量培養(yǎng)皿或燒瓶中。在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，哺乳動物原始生殖細(xì)胞(PGC)起源于靠近尿囊基部的卵黃內(nèi)胚層。隨著胚胎的發(fā)育和縱向翻轉(zhuǎn)，卵黃囊的一部分成為胚胎的后腸，PGC主要根據(jù)其在不同物種早期胚胎中的遷移位置進(jìn)行選擇。1.原始生殖細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)，收集8.5-10.5 DPC小鼠胚胎，用DHanks溶液輕度洗滌，然后在解剖顯微鏡下用鑷子解剖含有原始生殖細(xì)胞的生殖嵴組織(PGC)。用0.02的溶液孵育含有PGC細(xì)胞的生殖嵴組織37和15分鐘。用吸管打碎，接種到覆蓋有滋養(yǎng)層的4孔培養(yǎng)

12、板中?；A(chǔ)培養(yǎng)基，DMEM溶液，15%流式細(xì)胞儀，0.1毫摩爾/升巰基乙醇，50U/毫升青霉素，50ug/毫升鏈霉素，2毫摩爾/升谷氨酰胺，1毫摩爾/升丙酮酸鈉，2。滋養(yǎng)層細(xì)胞，優(yōu)選8代以內(nèi)的小鼠MEF細(xì)胞或STO細(xì)胞系。使用前，用10微克/毫升絲裂霉素在37處理23小時；將、接種在涂有0.1%明膠的培養(yǎng)板或細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)基是含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。3。EG細(xì)胞的純化和建立，培養(yǎng)物在滋養(yǎng)層細(xì)胞上分裂和增殖，46天后，含有原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下用胰蛋白酶消化，并轉(zhuǎn)移到新的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行增殖；用胰蛋白酶重復(fù)消化并轉(zhuǎn)移到新的滋養(yǎng)層細(xì)胞。經(jīng)過23次，干細(xì)胞集落的巢通常可以產(chǎn)生。最后

13、，將其轉(zhuǎn)移到含有滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，用于進(jìn)一步擴(kuò)增。此時，培養(yǎng)基中的生長因子如LIF、SCF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以減少或省略。(5)胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞系的特征和鑒定1、形態(tài)學(xué)特征：挑選克隆，用胰蛋白酶消化，接種于新的滋養(yǎng)層或特殊條件培養(yǎng)基中，培養(yǎng)34天后，分散的細(xì)胞再次成為島狀或巢狀細(xì)胞克隆。圓形或橢圓形，緊密堆疊成單層或多層，形成島狀或巢狀群生長形式；顯示一個或幾個核仁和高比率的核質(zhì)；不同物種胚胎干細(xì)胞的形態(tài)特征不同。人類胚胎干細(xì)胞是具有清晰細(xì)胞邊界的扁平群落；雖然小鼠胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞是成簇的，但它們是懸浮的，細(xì)胞邊界清晰。豬胚胎干細(xì)胞具有上皮表型，具有特征性的細(xì)胞骨架蛋白

14、表達(dá)。2。發(fā)育全能性和分化潛能的鑒定、免疫組織化學(xué)、階段特異性胚胎抗原(SSEA)、堿性磷酸酶(AKP)、Oct4基因表達(dá)、端粒酶、體外分化潛能、體內(nèi)分化、階段特異性胚胎抗原(SSEA)、胚胎干細(xì)胞和胚胎上皮細(xì)胞表面抗原的間接免疫熒光檢測。不同物種有不同的亞型，包括小鼠SSEA1、人SSEA3或SSEA4。堿性磷酸酶(AKP)活性在小鼠胚胎干細(xì)胞中較高，但在分化細(xì)胞中顯著降低。未分化細(xì)胞用1%多聚甲醛固定，直接用NBT溶液作為AKP底物染色。未分化細(xì)胞顯示Oct4基因表達(dá)，Oct4是生殖系的特異性轉(zhuǎn)錄因子，而小鼠早期胚胎發(fā)育中的多能干細(xì)胞、生殖細(xì)胞譜系和體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞是特異性表達(dá)標(biāo)記基因

15、；Oct4在人es和EG細(xì)胞中的表達(dá)尚不清楚。端粒酶是一種核糖核蛋白，與控制細(xì)胞生命有關(guān)。人胚胎干細(xì)胞的端粒酶活性極高，在分化細(xì)胞中很難檢測到其活性。體外分化潛能：胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞接種于缺乏滋養(yǎng)層細(xì)胞和白血病抑制因子培養(yǎng)基的瓊脂平板上，或加入適當(dāng)?shù)姆只T導(dǎo)物質(zhì)(如視黃酸)，或進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞粘附成團(tuán)；培養(yǎng)34天后，形成胚狀體，最外層分化成由較大細(xì)胞組成的內(nèi)胚層樣結(jié)構(gòu)，中間有未分化的干細(xì)胞；經(jīng)過810天的培養(yǎng)，胚狀體擴(kuò)大，內(nèi)腔出現(xiàn)，形成囊性胚狀體，可持續(xù)約3周。體內(nèi)分化，不同品系小鼠胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)的生長速度和分化能力不同。接種于同一品系或免疫缺陷小鼠的腹股溝、眼窩和腹腔，可

16、形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組成的畸胎瘤，并可通過組織學(xué)檢查分析胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞的全能性或多能性或能量限制的發(fā)育潛能。3。體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞分化的基本原理、定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞分化的基本方法、體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的幾種細(xì)胞(1)基本原理，誘導(dǎo)分化是胚胎正常發(fā)育中最重要和最基本的現(xiàn)象；在胚胎細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)物質(zhì)種類繁多，誘導(dǎo)方式各異，根據(jù)作用機(jī)理大致可分為兩類：(1)誘導(dǎo)的結(jié)果不僅取決于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和特異性，還取決于誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)能力；誘導(dǎo)細(xì)胞可逆的輕度損傷，導(dǎo)致細(xì)胞分化，如無機(jī)物、有機(jī)酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物，引起細(xì)胞滲透壓的輕微損傷，并通過與細(xì)胞

17、表面各自的受體結(jié)合誘導(dǎo)分化，如類固醇激素、視黃酸衍生物、多肽生長因子等。(2)胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞定向分化、體外誘導(dǎo)分化、譜系分化和定向分化，包括細(xì)胞從譜系祖細(xì)胞、譜系定型細(xì)胞向終末分化細(xì)胞分化的全過程。試圖控制并導(dǎo)致產(chǎn)生單一類型的分化細(xì)胞，這仍然是一個未解決的問題。(3)體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的基本方法。單層胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。胚狀體形成和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化，每兩天，1。單層胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化，0.25%胰蛋白酶消化，吹入單細(xì)胞，將25104細(xì)胞/毫升接種于0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，并更換，加入適當(dāng)濃度的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，常用的分化誘導(dǎo)劑，維甲酸二甲基亞砜環(huán)己二亞甲基雙乙酰胺等。通常單層培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞很難分化成單