生物工業(yè)分析 第5章 比色分析和分光光度法.ppt

1、生物產(chǎn)業(yè)分析，第五章比色分析和分光光度法第一節(jié)概述第二節(jié)比色分析和分光光度法第三節(jié)紫外分光光度法第四節(jié)其他分光光度法介紹，比色分析和分光光度法，第一節(jié)概述比色分析和分光光度法具有以下優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高。準(zhǔn)確度高。操作簡(jiǎn)單，分析速度快。應(yīng)用廣泛。比色分析和分光光度法，第二節(jié)比色分析和分光光度法1，基本原理1朗伯維爾的定律比色分析和分光光度分析定量物質(zhì)的基礎(chǔ)是蘭伯特維爾的定律。一束平行單色光通過均勻、未散射的稀溶液時(shí)，溶液吸收光的程度(即吸光度A) A=KCL格式：A吸光度；k吸收系數(shù)；l液體層厚度；c測(cè)量的物質(zhì)的濃度。氣相色譜分析，一般使用光吸收曲線說明測(cè)量對(duì)象溶液對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收，并依次通過一定

2、濃度的測(cè)量對(duì)象溶液測(cè)量光源中不同波長(zhǎng)的光。在不同的波長(zhǎng)下測(cè)量溶液的吸光度。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)繪制的吸光度A為縱坐標(biāo)的曲線稱為光吸收曲線或吸收光譜曲線。在光吸收光譜曲線中，與光吸收程度最大的地方對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，與最大吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的顏色是物質(zhì)吸收光的顏色。在一定條件下，物質(zhì)的吸收強(qiáng)度與濃度成正比，這是物質(zhì)定量分析的依據(jù)。在各種物質(zhì)的分子吸收光譜中，吸收棒的波長(zhǎng)位置、吸收棒的相對(duì)強(qiáng)度、吸收棒的形狀(峰值寬度)是對(duì)物質(zhì)定性和結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。氣相色譜分析、2儀器和使用方法(1)581-G型光電色度計(jì)581-G型光電色度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)如圖5-1所示。圖5-1581-G型光電比色計(jì)光學(xué)系統(tǒng)1光源2

3、反射鏡3吸熱玻璃4聚光5濾波器6比色盤7硒光電8檢流計(jì)，氣相色譜分析，其中光源燈泡為6.3V鎢燈泡。過濾器的作用是分離出最能被白光中測(cè)量的溶液吸收的一個(gè)波段的單色光，去除不被溶液吸收、妨礙測(cè)量的其他波段的光。通過比色分析選擇的過濾器的顏色必須是溶液的補(bǔ)色。每個(gè)過濾器都牙齒顯示牙齒過濾器可以通過的光波波長(zhǎng)值(nm)。581-G光電色度計(jì)配備了三種茄子過濾器：紅色(650nm)、綠色(530nm)和藍(lán)色(420nm)。括號(hào)中的波長(zhǎng)表示牙齒過濾器通過光的最強(qiáng)波長(zhǎng)。選擇過濾器的原則是過濾器通過的光必須是溶液吸收最強(qiáng)的光。這可以根據(jù)顏色的互補(bǔ)關(guān)系來選擇(請(qǐng)參閱表5-1)。氣相色譜分析、表5-1溶液顏色和

4、過濾器互補(bǔ)關(guān)系、氣相色譜分析、(2)721型分光光度計(jì)的工作波長(zhǎng)范圍為420720nm，主要設(shè)計(jì)為普通實(shí)驗(yàn)室在可見光區(qū)域進(jìn)行一般定量比色分析。圖5-2所示的721型分光光度計(jì)的原理示意圖。圖5-2721分光光度計(jì)原理示意性1光源2光透鏡3反射鏡4彎曲窄間隙5保護(hù)玻璃6準(zhǔn)直徑7棱鏡8光調(diào)光調(diào)節(jié)器9光調(diào)光調(diào)節(jié)器10光吸收器11光門12保護(hù)玻璃13光管14直流放大器15微安培表、氣色分析、721英寸分光光度計(jì)使用3360預(yù)熱20分鐘，同時(shí)啟動(dòng)檢流計(jì)的電源開關(guān)，檢流計(jì)0點(diǎn)粗請(qǐng)等到機(jī)器穩(wěn)定后再使用。選擇波長(zhǎng)測(cè)量。將含有溶液的有色碗放在有色盤子架上，將空溶液放在第一格，將發(fā)色溶液放在另一格，蓋住深色箱子。

5、氣相色譜分析，空溶液透光的程度為100。然后，依次輕拉有色盤位置控制桿，使測(cè)量對(duì)象溶液按光路順序進(jìn)入，讀取吸光度或透射率。如果需要，可以將空溶液推至光路，檢查吸光度0，然后再讀一遍。使用完畢后，應(yīng)打開有色盤盒的襟翼，切斷檢查器的電源，最后切斷儀器的電源，用蓋子蓋住儀器。同時(shí)，用蒸餾水清洗有色碗，保存在有色盤專用箱子里。使用時(shí)，建議在連續(xù)使用以下事項(xiàng)：裝置2小時(shí)后，休息30分鐘，繼續(xù)使用。操作時(shí)，應(yīng)盡量避免試驗(yàn)液落到有色盤的深色盒子里或儀器的面板上，如果有鈴鐺，要及時(shí)擦拭，以免腐蝕儀器。氣相色譜分析，2，定量分析方法(1)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法用于個(gè)別樣品的分析。首先測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度稱為Cs)的吸光度A

6、s，然后在相同條件下測(cè)量樣品溶液的吸光度Ax(因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件相同，K，L是值，符合比爾的定律)。您可以根據(jù)公式CxAs=CsAx計(jì)算要測(cè)試的樣例的濃度。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于批量樣品分析。首先，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)量吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。樣品也經(jīng)過同樣的處理，在標(biāo)準(zhǔn)溶液等條件下測(cè)定吸光度。根據(jù)樣品的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中找到了相應(yīng)的濃度。氣相頻譜分析，3，案例1應(yīng)用啤酒色度的測(cè)量基本原理啤酒(或蜜汁)的顏色越深，特定波長(zhǎng)下的吸光度越大，因此吸光度可以直接表示啤酒的色度。也可以用EBC比色計(jì)測(cè)量。測(cè)量的樣品必須清澈透明。牙齒實(shí)驗(yàn)使用GB4927

7、2001中規(guī)定的方法：使用EBC比色計(jì)去除氣體后，將樣品注入EBC比色計(jì)，并與標(biāo)準(zhǔn)EBC調(diào)色板進(jìn)行比較，以視覺讀數(shù)或自動(dòng)數(shù)字顯示樣品的色度(以EBC色度為單位)。儀器EBC色度儀(或使用等效分析效果的儀器):具有2EBC27EBC單位的視覺色度盤或自動(dòng)數(shù)據(jù)處理和顯示器設(shè)備。氣相色譜分析、試劑和溶液河?xùn)|基準(zhǔn)溶液：重鉻酸鉀(K2Cr2O7)0.100g和亞硝酸鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)3NO2H2O)3.500g，溶水操作(CN)除去煤氣后的酒的形狀清澈透明。但是，啤酒樣品暴露在空氣和陽(yáng)光中的時(shí)間要盡可能短，以減少測(cè)量誤差。氣相頻譜分析，(B)儀器的校準(zhǔn)，將河?xùn)|溶液注入40毫米比色碗，用比色計(jì)測(cè)

8、量，標(biāo)準(zhǔn)色度應(yīng)為15EBC單位。如果使用25毫米的有色碗，則標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)為9.4EBC。儀器的校準(zhǔn)需要每月進(jìn)行一次。(C)色度測(cè)量將明確的樣品注入25毫米比色碗，然后放入比色器，與標(biāo)準(zhǔn)調(diào)色板進(jìn)行比較，兩種色調(diào)匹配時(shí)直接讀出。或者，使用自動(dòng)數(shù)字顯示顏色表，自動(dòng)顯示和打印結(jié)果。氣色頻譜分析、計(jì)算(A)如果使用其他規(guī)格的有色碗，則應(yīng)使用轉(zhuǎn)換為25毫米有色碗的數(shù)據(jù)報(bào)告結(jié)果。詩(shī)篇的色度計(jì)算如下。詩(shī)篇的色度(EBC單位)25式：S實(shí)測(cè)色度(EBC)；使用h有色碟的厚度(mm)；換算成25標(biāo)準(zhǔn)比色碟子的厚度。(b)在測(cè)量濃度和黑啤酒時(shí)，必須將模子稀釋為適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，然后將測(cè)量結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，以整數(shù)表示。氣相色譜

9、分析，2啤酒中鐵的測(cè)定(比色法)的基本原理是在未酸性條件下，相鄰的二茂鐵和Fe2離子生成橙色復(fù)合物，用比色法測(cè)定啤酒中的鐵含量。反應(yīng)如下：鄰菲咯啉橙，氣相色譜分析，試劑和儀器試劑(a)鄰菲咯啉溶液加熱至0.30克鄰菲咯啉，加100毫升水，70溶出。(B)抗壞血酸溶液取2.5克抗壞血酸，溶于水，稀釋為100毫升。牙齒試劑必須當(dāng)天制造。(C)標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液準(zhǔn)確地取1.755g硫酸鐵銨Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O，溶于水，加入0.6毫升濃鹽酸，將水定量到250毫升。使用時(shí)吸收5毫升牙齒溶液，用水稀釋至1000毫升，每毫升含鐵5克。儀器可見光范圍的分光光度計(jì)，比色管，1厘米比色盤。，氣相色譜分析

10、，測(cè)定步驟正確吸收標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(5g/mL)0.0，1.5，2.5，3.5，5.0，10.0 mL，分別裝入6個(gè)50mL容量瓶，水按比例均勻搖晃。濃度分別為0.0。在6個(gè)有色管中分別正確吸入徐璐不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)鐵稀釋溶液25毫升。正確地吸出25毫升脫氣啤酒，放入其他有色管。在上述7個(gè)比色法管中分別加入1毫升抗壞血酸溶液，搖得好，加入2毫升鄰二茂鐵溶液，搖得好，在60水浴中保持15min，冷卻。然后用505納米到1厘米的比色杯測(cè)量吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)鐵的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以樣品管的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中找出樣品管的鐵含量。氣相頻譜分析、(A)趙霽試劑和測(cè)量中使用的水平衡計(jì)再蒸

11、成玻璃儀器的蒸餾水探討。(B)磷素比色法測(cè)定鐵，靈敏度高，溶液中含有0.1 mg/L時(shí)顏色也明顯，色澤穩(wěn)定，比顏色容易。(C)添加抗壞血酸的作用是將三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)鐵離子。(D) 2價(jià)鐵離子和相鄰信息素在pH29范圍內(nèi)都可以發(fā)色，但為了減少其他離子對(duì)測(cè)量的影響，通常在pH5的微酸性溶液中發(fā)色。啤酒的PH值接近于此，所以不需要加入緩沖溶液。氣相色譜法分析，三百股中雜醇油的測(cè)定(比色法)基本原理雜醇油中異丁醇、異丙醇作為脫水劑濃硫酸的存在，可以與芳香醛收縮，合成有色物質(zhì)，可以用比色法測(cè)定。發(fā)色劑為雙甲基氨基苯甲醛，標(biāo)準(zhǔn)雜醇油使用異丁醇和異丙醇(1:4)的混合液。試劑及儀器試劑(a)0.5%對(duì)二

12、甲基氨基苯醛濃硫酸溶液稱為0.5g對(duì)二甲基氨基苯醛，可溶于100毫升濃硫酸，牙齒試劑需要新鮮配制。(B)標(biāo)準(zhǔn)雜醇溶液正確吸收0.26毫升重蒸汽異丁醇和1.04毫升重蒸汽異丙醇，放入100毫升容量瓶?jī)?nèi)，加入50毫升無雜醇乙醇，以蒸餾水為刻度，牙齒試劑每毫升含10毫克雜醇油，使用時(shí)要稀釋0.1毫克/毫升。氣相色譜分析，(C)無酒精乙醇分析純無水乙醇200毫升，添加0.25克鹽酸m-苯基二胺，在沸水浴中回流2小時(shí)，在沸水浴中蒸餾酒切換，收集100毫升中間餾分約100毫升(檢查方法：0.1毫升制備的無雜酒精乙醇10毫升比色法(D)樣品的制備吸出1毫升(V1)模子，并加入蒸餾水到10毫升。儀器可見光范圍

13、的分光光度計(jì)，比色管，1厘米比色盤。氣相頻譜分析，測(cè)定步驟為10毫升的比色管，加入各溶液。上述各有色管在冰浴中沿略微傾斜的有色管壁慢慢加入0.5%對(duì)甲氨醛濃硫酸溶液2mL，將硫酸溶液搖勻至管底，加入沸水浴中，加熱15min后，消除快速冷卻。然后分別加入2毫升蒸餾水(顏色濃度可加5毫升)混合。10min后波長(zhǎng)520nm下的吸光度測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制、樣品質(zhì)量測(cè)定的吸光度研究了標(biāo)準(zhǔn)曲線上酒樣品稀釋液中甾體油的含量。氣相色譜分析，計(jì)算樣品管中fusel oil的含量(mg) fusel oil (g/100mL)=100式中：從V1提取的葡萄酒樣品體積(ML)；V2葡萄酒稀釋劑的體積(mL)。闡述

14、了二甲基氨基苯甲醛濃硫酸溶液和對(duì)丙醇、異丙醇和正丁醇的比色反應(yīng)。因此，以酒精為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算白酒中雜醇油的含量是有誤差的。正確定量白酒中雜醇油的含量應(yīng)用氣相色譜法。、氣相色譜分析、4 msg中鋅測(cè)定的基本原理在pH4.05.5的弱酸性介質(zhì)中形成鋅和二硫腙(又稱三苯腙、二苯腙、二苯腙、二苯硫酰肼、二苯硫脲、二苯氨基硫脲、二苯氨基硫脲等)牙齒紅色，反應(yīng)如下：(b)20%鹽酸羥胺溶液將20g鹽酸羥胺溶解在100mL蒸餾水中，放入餾分漏斗，用0.004%二硫腙四氯化碳溶液二次萃取，直到四氯化碳層呈綠色。(C)乙酸-醋酸鈉緩沖溶液混合2mol/L醋酸溶液和2mol/L醋酸鈉溶液等體積，放在分液漏斗中，用0.0

15、04%二硫腙四氯化碳溶液連續(xù)萃取，直到四氯化碳層變成綠色為止。(d)1%硫化鈉溶液接受1g硫化鈉，溶于100毫升蒸餾水即可。(e)0.004%雙硫腙四氯化碳溶液稱為0.04G雙硫水螅腙(0.04g雙硫腙)，可溶于1000mL四氯化碳。(F) MSG樣品溶液正確取5g MSG樣品，溶解20毫升蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到250毫升餾分漏斗即可。儀器可見光范圍的分光光度計(jì)。氣相色譜分析，測(cè)定階段(A)標(biāo)準(zhǔn)系列的準(zhǔn)備正確地吸收0，2，4，6，8，10毫升標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液(1g/mL)，分別放入250毫升餾分漏斗中，并分別放入10毫升乙酸鈉緩沖液。加入10mL0.004%雙硫腙四氯化碳溶液，劇烈搖晃15min，形成靜

16、止層，取四氯化碳層比色。(b)味覺精液的處理和標(biāo)準(zhǔn)系列液的處理。(C)以530nm波長(zhǎng)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)系列和MSG樣品的吸光度，以橫坐標(biāo)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液的濃度，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中獲取與MSG樣品吸光度對(duì)應(yīng)的鋅含量(微克數(shù))，然后計(jì)算處理。氣相色譜分析，計(jì)算：W1標(biāo)準(zhǔn)曲線中發(fā)現(xiàn)鋅的微克數(shù)；從W2中提取的調(diào)味品重量。討論(A)實(shí)驗(yàn)表明，雙硫腙鋅配合物可在pH4.75.2范圍內(nèi)由四氯化碳定量提取，顏色至少在2h范圍內(nèi)穩(wěn)定。(B)在測(cè)定過程中添加20%的鹽酸羥胺溶液，是為了防止雙硫腙氧化。(C)在測(cè)量過程中添加硫化鈉溶液，是為了防止銅、汞、金、鉍、鉛、鎘等金屬離子干擾測(cè)量。氣相色譜分析、5檸檬酸中砷的測(cè)定(砷斑點(diǎn)比色法，又稱古特提色法)基本原理三氧化二砷和砷酸在酸性溶液中由氫快速還原成砷。反應(yīng)中產(chǎn)生的砷，吸收了醋酸鉛可以混入濕潤(rùn)的棉花中的硫化氫，浸泡了溴化汞(或氯化汞)，在測(cè)定過程中，為了加快砷酸(H3AsO4)的還原，添加碘化鉀，將砷還原為砷酸，生成的碘還原為酸性氯化亞錫，氯化亞錫可以將5價(jià)砷還原為3價(jià)砷化合物。溴化汞(或氯化汞)試紙的著色強(qiáng)度與樣品中砷的含量成正比。因此，用已知砷量的標(biāo)準(zhǔn)溶液處理的試卷上色，可以測(cè)定樣品中砷的含量。氣相色譜分析，試劑和儀器試劑(A)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確地加入0.