生物工業(yè)分析 第5章 比色分析和分光光度法.ppt

1、生物產(chǎn)業(yè)分析，第五章比色分析和分光光度法第一節(jié)概述第二節(jié)比色分析和分光光度法第三節(jié)紫外分光光度法第四節(jié)其他分光光度法介紹，比色分析和分光光度法，第一節(jié)概述比色分析和分光光度法具有以下優(yōu)點：靈敏度高。準(zhǔn)確度高。操作簡單，分析速度快。應(yīng)用廣泛。比色分析和分光光度法，第二節(jié)比色分析和分光光度法1，基本原理1朗伯維爾的定律比色分析和分光光度分析定量物質(zhì)的基礎(chǔ)是蘭伯特維爾的定律。一束平行單色光通過均勻、未散射的稀溶液時，溶液吸收光的程度(即吸光度A) A=KCL格式：A吸光度；k吸收系數(shù)；l液體層厚度；c測量的物質(zhì)的濃度。氣相色譜分析，一般使用光吸收曲線說明測量對象溶液對各種波長光的吸收，并依次通過一定

2、濃度的測量對象溶液測量光源中不同波長的光。在不同的波長下測量溶液的吸光度。以波長為橫坐標(biāo)繪制的吸光度A為縱坐標(biāo)的曲線稱為光吸收曲線或吸收光譜曲線。在光吸收光譜曲線中，與光吸收程度最大的地方對應(yīng)的波長是該物質(zhì)的最大吸收波長，與最大吸收波長對應(yīng)的顏色是物質(zhì)吸收光的顏色。在一定條件下，物質(zhì)的吸收強度與濃度成正比，這是物質(zhì)定量分析的依據(jù)。在各種物質(zhì)的分子吸收光譜中，吸收棒的波長位置、吸收棒的相對強度、吸收棒的形狀(峰值寬度)是對物質(zhì)定性和結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。氣相色譜分析、2儀器和使用方法(1)581-G型光電色度計581-G型光電色度計光學(xué)系統(tǒng)如圖5-1所示。圖5-1581-G型光電比色計光學(xué)系統(tǒng)1光源2

3、反射鏡3吸熱玻璃4聚光5濾波器6比色盤7硒光電8檢流計，氣相色譜分析，其中光源燈泡為6.3V鎢燈泡。過濾器的作用是分離出最能被白光中測量的溶液吸收的一個波段的單色光，去除不被溶液吸收、妨礙測量的其他波段的光。通過比色分析選擇的過濾器的顏色必須是溶液的補色。每個過濾器都牙齒顯示牙齒過濾器可以通過的光波波長值(nm)。581-G光電色度計配備了三種茄子過濾器：紅色(650nm)、綠色(530nm)和藍(lán)色(420nm)。括號中的波長表示牙齒過濾器通過光的最強波長。選擇過濾器的原則是過濾器通過的光必須是溶液吸收最強的光。這可以根據(jù)顏色的互補關(guān)系來選擇(請參閱表5-1)。氣相色譜分析、表5-1溶液顏色和

4、過濾器互補關(guān)系、氣相色譜分析、(2)721型分光光度計的工作波長范圍為420720nm，主要設(shè)計為普通實驗室在可見光區(qū)域進(jìn)行一般定量比色分析。圖5-2所示的721型分光光度計的原理示意圖。圖5-2721分光光度計原理示意性1光源2光透鏡3反射鏡4彎曲窄間隙5保護(hù)玻璃6準(zhǔn)直徑7棱鏡8光調(diào)光調(diào)節(jié)器9光調(diào)光調(diào)節(jié)器10光吸收器11光門12保護(hù)玻璃13光管14直流放大器15微安培表、氣色分析、721英寸分光光度計使用3360預(yù)熱20分鐘，同時啟動檢流計的電源開關(guān)，檢流計0點粗請等到機(jī)器穩(wěn)定后再使用。選擇波長測量。將含有溶液的有色碗放在有色盤子架上，將空溶液放在第一格，將發(fā)色溶液放在另一格，蓋住深色箱子。

5、氣相色譜分析，空溶液透光的程度為100。然后，依次輕拉有色盤位置控制桿，使測量對象溶液按光路順序進(jìn)入，讀取吸光度或透射率。如果需要，可以將空溶液推至光路，檢查吸光度0，然后再讀一遍。使用完畢后，應(yīng)打開有色盤盒的襟翼，切斷檢查器的電源，最后切斷儀器的電源，用蓋子蓋住儀器。同時，用蒸餾水清洗有色碗，保存在有色盤專用箱子里。使用時，建議在連續(xù)使用以下事項：裝置2小時后，休息30分鐘，繼續(xù)使用。操作時，應(yīng)盡量避免試驗液落到有色盤的深色盒子里或儀器的面板上，如果有鈴鐺，要及時擦拭，以免腐蝕儀器。氣相色譜分析，2，定量分析方法(1)標(biāo)準(zhǔn)計算方法用于個別樣品的分析。首先測量標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度稱為Cs)的吸光度A

6、s，然后在相同條件下測量樣品溶液的吸光度Ax(因為實驗條件相同，K，L是值，符合比爾的定律)。您可以根據(jù)公式CxAs=CsAx計算要測試的樣例的濃度。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于批量樣品分析。首先，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測量吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。樣品也經(jīng)過同樣的處理，在標(biāo)準(zhǔn)溶液等條件下測定吸光度。根據(jù)樣品的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中找到了相應(yīng)的濃度。氣相頻譜分析，3，案例1應(yīng)用啤酒色度的測量基本原理啤酒(或蜜汁)的顏色越深，特定波長下的吸光度越大，因此吸光度可以直接表示啤酒的色度。也可以用EBC比色計測量。測量的樣品必須清澈透明。牙齒實驗使用GB4927

7、2001中規(guī)定的方法：使用EBC比色計去除氣體后，將樣品注入EBC比色計，并與標(biāo)準(zhǔn)EBC調(diào)色板進(jìn)行比較，以視覺讀數(shù)或自動數(shù)字顯示樣品的色度(以EBC色度為單位)。儀器EBC色度儀(或使用等效分析效果的儀器):具有2EBC27EBC單位的視覺色度盤或自動數(shù)據(jù)處理和顯示器設(shè)備。氣相色譜分析、試劑和溶液河?xùn)|基準(zhǔn)溶液：重鉻酸鉀(K2Cr2O7)0.100g和亞硝酸鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)3NO2H2O)3.500g，溶水操作(CN)除去煤氣后的酒的形狀清澈透明。但是，啤酒樣品暴露在空氣和陽光中的時間要盡可能短，以減少測量誤差。氣相頻譜分析，(B)儀器的校準(zhǔn)，將河?xùn)|溶液注入40毫米比色碗，用比色計測

8、量，標(biāo)準(zhǔn)色度應(yīng)為15EBC單位。如果使用25毫米的有色碗，則標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)為9.4EBC。儀器的校準(zhǔn)需要每月進(jìn)行一次。(C)色度測量將明確的樣品注入25毫米比色碗，然后放入比色器，與標(biāo)準(zhǔn)調(diào)色板進(jìn)行比較，兩種色調(diào)匹配時直接讀出?；蛘?，使用自動數(shù)字顯示顏色表，自動顯示和打印結(jié)果。氣色頻譜分析、計算(A)如果使用其他規(guī)格的有色碗，則應(yīng)使用轉(zhuǎn)換為25毫米有色碗的數(shù)據(jù)報告結(jié)果。詩篇的色度計算如下。詩篇的色度(EBC單位)25式：S實測色度(EBC)；使用h有色碟的厚度(mm)；換算成25標(biāo)準(zhǔn)比色碟子的厚度。(b)在測量濃度和黑啤酒時，必須將模子稀釋為適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，然后將測量結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，以整數(shù)表示。氣相色譜

9、分析，2啤酒中鐵的測定(比色法)的基本原理是在未酸性條件下，相鄰的二茂鐵和Fe2離子生成橙色復(fù)合物，用比色法測定啤酒中的鐵含量。反應(yīng)如下：鄰菲咯啉橙，氣相色譜分析，試劑和儀器試劑(a)鄰菲咯啉溶液加熱至0.30克鄰菲咯啉，加100毫升水，70溶出。(B)抗壞血酸溶液取2.5克抗壞血酸，溶于水，稀釋為100毫升。牙齒試劑必須當(dāng)天制造。(C)標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液準(zhǔn)確地取1.755g硫酸鐵銨Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O，溶于水，加入0.6毫升濃鹽酸，將水定量到250毫升。使用時吸收5毫升牙齒溶液，用水稀釋至1000毫升，每毫升含鐵5克。儀器可見光范圍的分光光度計，比色管，1厘米比色盤。，氣相色譜分析

10、，測定步驟正確吸收標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(5g/mL)0.0，1.5，2.5，3.5，5.0，10.0 mL，分別裝入6個50mL容量瓶，水按比例均勻搖晃。濃度分別為0.0。在6個有色管中分別正確吸入徐璐不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)鐵稀釋溶液25毫升。正確地吸出25毫升脫氣啤酒，放入其他有色管。在上述7個比色法管中分別加入1毫升抗壞血酸溶液，搖得好，加入2毫升鄰二茂鐵溶液，搖得好，在60水浴中保持15min，冷卻。然后用505納米到1厘米的比色杯測量吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)鐵的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以樣品管的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中找出樣品管的鐵含量。氣相頻譜分析、(A)趙霽試劑和測量中使用的水平衡計再蒸

11、成玻璃儀器的蒸餾水探討。(B)磷素比色法測定鐵，靈敏度高，溶液中含有0.1 mg/L時顏色也明顯，色澤穩(wěn)定，比顏色容易。(C)添加抗壞血酸的作用是將三價鐵離子還原為二價鐵離子。(D) 2價鐵離子和相鄰信息素在pH29范圍內(nèi)都可以發(fā)色，但為了減少其他離子對測量的影響，通常在pH5的微酸性溶液中發(fā)色。啤酒的PH值接近于此，所以不需要加入緩沖溶液。氣相色譜法分析，三百股中雜醇油的測定(比色法)基本原理雜醇油中異丁醇、異丙醇作為脫水劑濃硫酸的存在，可以與芳香醛收縮，合成有色物質(zhì)，可以用比色法測定。發(fā)色劑為雙甲基氨基苯甲醛，標(biāo)準(zhǔn)雜醇油使用異丁醇和異丙醇(1:4)的混合液。試劑及儀器試劑(a)0.5%對二

12、甲基氨基苯醛濃硫酸溶液稱為0.5g對二甲基氨基苯醛，可溶于100毫升濃硫酸，牙齒試劑需要新鮮配制。(B)標(biāo)準(zhǔn)雜醇溶液正確吸收0.26毫升重蒸汽異丁醇和1.04毫升重蒸汽異丙醇，放入100毫升容量瓶內(nèi)，加入50毫升無雜醇乙醇，以蒸餾水為刻度，牙齒試劑每毫升含10毫克雜醇油，使用時要稀釋0.1毫克/毫升。氣相色譜分析，(C)無酒精乙醇分析純無水乙醇200毫升，添加0.25克鹽酸m-苯基二胺，在沸水浴中回流2小時，在沸水浴中蒸餾酒切換，收集100毫升中間餾分約100毫升(檢查方法：0.1毫升制備的無雜酒精乙醇10毫升比色法(D)樣品的制備吸出1毫升(V1)模子，并加入蒸餾水到10毫升。儀器可見光范圍

13、的分光光度計，比色管，1厘米比色盤。氣相頻譜分析，測定步驟為10毫升的比色管，加入各溶液。上述各有色管在冰浴中沿略微傾斜的有色管壁慢慢加入0.5%對甲氨醛濃硫酸溶液2mL，將硫酸溶液搖勻至管底，加入沸水浴中，加熱15min后，消除快速冷卻。然后分別加入2毫升蒸餾水(顏色濃度可加5毫升)混合。10min后波長520nm下的吸光度測定、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制、樣品質(zhì)量測定的吸光度研究了標(biāo)準(zhǔn)曲線上酒樣品稀釋液中甾體油的含量。氣相色譜分析，計算樣品管中fusel oil的含量(mg) fusel oil (g/100mL)=100式中：從V1提取的葡萄酒樣品體積(ML)；V2葡萄酒稀釋劑的體積(mL)。闡述

14、了二甲基氨基苯甲醛濃硫酸溶液和對丙醇、異丙醇和正丁醇的比色反應(yīng)。因此，以酒精為標(biāo)準(zhǔn)計算白酒中雜醇油的含量是有誤差的。正確定量白酒中雜醇油的含量應(yīng)用氣相色譜法。、氣相色譜分析、4 msg中鋅測定的基本原理在pH4.05.5的弱酸性介質(zhì)中形成鋅和二硫腙(又稱三苯腙、二苯腙、二苯腙、二苯硫酰肼、二苯硫脲、二苯氨基硫脲、二苯氨基硫脲等)牙齒紅色，反應(yīng)如下：(b)20%鹽酸羥胺溶液將20g鹽酸羥胺溶解在100mL蒸餾水中，放入餾分漏斗，用0.004%二硫腙四氯化碳溶液二次萃取，直到四氯化碳層呈綠色。(C)乙酸-醋酸鈉緩沖溶液混合2mol/L醋酸溶液和2mol/L醋酸鈉溶液等體積，放在分液漏斗中，用0.0

15、04%二硫腙四氯化碳溶液連續(xù)萃取，直到四氯化碳層變成綠色為止。(d)1%硫化鈉溶液接受1g硫化鈉，溶于100毫升蒸餾水即可。(e)0.004%雙硫腙四氯化碳溶液稱為0.04G雙硫水螅腙(0.04g雙硫腙)，可溶于1000mL四氯化碳。(F) MSG樣品溶液正確取5g MSG樣品，溶解20毫升蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到250毫升餾分漏斗即可。儀器可見光范圍的分光光度計。氣相色譜分析，測定階段(A)標(biāo)準(zhǔn)系列的準(zhǔn)備正確地吸收0，2，4，6，8，10毫升標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液(1g/mL)，分別放入250毫升餾分漏斗中，并分別放入10毫升乙酸鈉緩沖液。加入10mL0.004%雙硫腙四氯化碳溶液，劇烈搖晃15min，形成靜

16、止層，取四氯化碳層比色。(b)味覺精液的處理和標(biāo)準(zhǔn)系列液的處理。(C)以530nm波長測量標(biāo)準(zhǔn)系列和MSG樣品的吸光度，以橫坐標(biāo)測量標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液的濃度，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中獲取與MSG樣品吸光度對應(yīng)的鋅含量(微克數(shù))，然后計算處理。氣相色譜分析，計算：W1標(biāo)準(zhǔn)曲線中發(fā)現(xiàn)鋅的微克數(shù)；從W2中提取的調(diào)味品重量。討論(A)實驗表明，雙硫腙鋅配合物可在pH4.75.2范圍內(nèi)由四氯化碳定量提取，顏色至少在2h范圍內(nèi)穩(wěn)定。(B)在測定過程中添加20%的鹽酸羥胺溶液，是為了防止雙硫腙氧化。(C)在測量過程中添加硫化鈉溶液，是為了防止銅、汞、金、鉍、鉛、鎘等金屬離子干擾測量。氣相色譜分析、5檸檬酸中砷的測定(砷斑點比色法，又稱古特提色法)基本原理三氧化二砷和砷酸在酸性溶液中由氫快速還原成砷。反應(yīng)中產(chǎn)生的砷，吸收了醋酸鉛可以混入濕潤的棉花中的硫化氫，浸泡了溴化汞(或氯化汞)，在測定過程中，為了加快砷酸(H3AsO4)的還原，添加碘化鉀，將砷還原為砷酸，生成的碘還原為酸性氯化亞錫，氯化亞錫可以將5價砷還原為3價砷化合物。溴化汞(或氯化汞)試紙的著色強度與樣品中砷的含量成正比。因此，用已知砷量的標(biāo)準(zhǔn)溶液處理的試卷上色，可以測定樣品中砷的含量。氣相色譜分析，試劑和儀器試劑(A)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確地加入0.