蛋白質分子量測定方法研究進展課件

1、蛋白質分子質量測定方法概述,1,學習交流PPT,目錄,2,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳技術是實驗室進行蛋白質研究中最常用的技術，兼有電泳和分子篩的雙重作用。 SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質變性，與其蛋白質結合成帶負電荷的蛋白質-SDS復合體，消除電泳過程中蛋白質所帶電荷對電泳結果的影響，從而保證蛋白質電泳僅受分子質量大小的影響。在一定的電場作用下，該復合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠形成的分子篩向電場的正極移動，從而將蛋白質根據(jù)他們的分子量大小而分開。 蛋白質-SDS復合體：形狀一定、電荷密度一定,3,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,上樣：防止樣品溢出、

2、正負極、電壓,4,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,當?shù)鞍踪|分子量在10-200kDa時，樣品的遷移率和分子量的對數(shù)呈對數(shù)關系，符合如下方程式： lgMW = -bRf + K 其中，MW為蛋白質分子質量，Rf為相對遷移率，b為斜率，K為截距，當條件一定時，b和K為常數(shù)。 因此通過已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比較，就能得出未知蛋白的分子量。,5,學習交流PPT,影響分子量測定的因素很多，包括蛋白質與SDS的結合量的不同，凝膠濃度和交聯(lián)劑濃度等，如圖所示。研究者測定了當交聯(lián)劑濃度不變，改變凝膠濃度，下圖分別對應于凝膠濃度為5%，10%，15%。,SDS-PAGE凝膠電泳,6,學習交

3、流PPT,優(yōu)點：操作簡單，容易掌握，成本低，分辨率高，重復效果好。 缺點：對于電荷異常或者構象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白及一些結構蛋白測定的分子質量不太可靠，而且電泳結束后還需要染色，染色，脫色比較耗時。,SDS-PAGE凝膠電泳,7,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,定義：又叫體積排阻層析、分子篩層析，當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行的分離技術。 固定相：惰性凝膠顆粒，顆粒內部立體網狀結構，形成許多孔穴 原理：,8,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠（Sepharose）,9,學習交流P

4、PT,凝膠滲透層析法,洗脫體積Ve與分子量的關系可用下式表示： Ve=K1K2logMW （K1、K2為常數(shù)，MW為分子量） 從公式可以看出，目標樣品的流出體積與分子量對數(shù)成線性關系。在實際操作過程中，選取標準品與樣品同時通過凝膠柱，通過已知標準品的流出體積和分子量可以計算出曲線中的K1、K2值，再根據(jù)已知的曲線方程和樣品流出體積計算樣品的分子量。,10,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,優(yōu)點：操作簡單，設備簡單，樣品用量少，周期簡單，條件溫和，一般不引起生物活性的改變。 缺點：應用具有一定的局限性，在pH68的范圍內，線性關系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量

5、超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。,11,學習交流PPT,質譜法,1906年，Thomson發(fā)明了質譜技術，最初只是用于無機化學中的同位素分析，直至20世紀40年代末才發(fā)展成為有機質譜。近年來，生物質譜技術取得了突飛猛進的發(fā)展，其中以分別由美國科學家John.B.Fenn和日本科學家田中耕一發(fā)明的電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）及基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）的貢獻最為突出。 可準確測定分子量,12,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）,原理：電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電

6、壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷密度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質譜技術。ESI-MS測定蛋白質大分子是根據(jù)一簇多電荷的質譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質的分子量，由于ESI-MS可以產生多電荷峰，因此使得測試的分子質量范圍大大擴大。,13,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）,電噴霧是一種離子化方法，可以用作質譜儀的離子源,14,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）,多電荷使得樣品譜圖復雜 荷質比：,15,學習交流PPT,

7、1.電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）,優(yōu)點： （1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費； （2）對樣品分子質量測試靈敏度、分辨力和準確度都相當高； （3）能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。 缺點： 對樣品純度要求高，且會形成多電荷的質譜峰群，難以分辨，使得結果分析較為困難。,16,學習交流PPT,2.基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）,原理：基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量后，

8、均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化。 將它與經典的脈沖化工作方式的飛行時間質譜儀（TOF）直接聯(lián)用，即我們常聽到的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。,17,學習交流PPT,2.基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）,優(yōu)點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少； （2）MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過ESI-MS； （3）有利于對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮

9、發(fā)成分，降低了對樣品預處理的要求； （4）MALDI-TOF 質譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣。 缺點：在與高效液相色譜、毛細管電泳等分離設備的聯(lián)用時，目前只能采取離線的方式，致使分析結果的重復性較差，與MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。,18,學習交流PPT,其他方法,除了以上幾種目前實驗室常用的測定方法，還有一些現(xiàn)在在實驗室一般不太使用的方法，包括粘度法，滲透壓法，輻射失活法，超速離心沉降法，光散射法等。,19,學習交流PPT,1.粘度法,粘度法是指通過測定樣品溶液的粘度，從而計算樣品的的分子量的方法。一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性

10、，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現(xiàn)出的特性粘度也大。 特性粘度與相對分子量M之間遵循Mark-Houwink經驗方程： =KM。K和值與溫度、聚合物、溶劑性質有關，也和分子量大小有關。,20,學習交流PPT,2.滲透壓法,在一種理想溶液中，滲透壓與溶質濃度成正比。 但是實際上蛋白質溶液與理想溶液有較大的偏差。 滲透壓法測定蛋白質分子量靈敏度較低，測定誤差較大，與SDS-PAGE法和凝膠色譜法等相比不常用于蛋白質分子量的測定。,21,學習交流

11、PPT,3.輻射失活法,輻射失活法無需純化和溶解蛋白質，可在原位測定其分子量。高能射線照射生物組織會產生電離作用，若在一定范圍內輻射能量破壞蛋白質分子的C-H鍵，使蛋白質喪失功能，電離作用減少。 D：輻射能量 輻射失活法作為一種獨特的蛋白質分子量測定方法，具有獨特的優(yōu)點，尤其是在膜蛋白研究方面，提供了一個測定膜蛋白分子量和研究其結構的手段，但由于高能射線使用的局限性，在生化研究中不常用。,22,學習交流PPT,4.超速離心沉降法,利用超速離心沉降法測蛋白質的分子量是在較低轉速下進行的（8000-20000r/min）。離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，一段時間以后，沉降的結果造成了濃度梯度，因而產生了蛋白質分子反向擴散運動，當反向擴散與離心沉降達到平衡時，濃度梯度就固定不變了，但是目前由于操作繁瑣，已經不在一般實驗室使用。,23,學習交流PPT,5.光散射法,主要基于染料陰離子在蛋白質等電點前與肽鏈上帶正電荷的基團上的結合作用。此時生色團聚集于蛋白質分子上引起共振散射光增強，它與核酸不同的是生色團必須是帶負電荷的陰離