維生素的測定ppt課件.ppt

1、5.7 維生素的測定,概述 脂溶性維生素A、E的測定 水溶性維生素 B、C的測定,1,5.7.1 概述,（1）維生素的分類及生理功能 （2）測定的目的和意義 （3）維生素的測定方法,2,1、維生素的分類及生理功能,功能： 維生素是維持人體正常生命活動所必需的一類小分子有機化合物。它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多，目前已經(jīng)確認(rèn)的有30多種，其中有20種被認(rèn)為與維持人體健康和促進(jìn)生長發(fā)育是至關(guān)重要的。維生素的主要功能是通過作為輔酶的成分調(diào)節(jié)代謝過程，人體對它的需要量極少，但作用非常大。它一般在體內(nèi)不能合成或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝取；長期缺乏任何一種維生素都會導(dǎo)致相關(guān)新陳代謝的紊亂，出現(xiàn)各種

2、特有的癥狀。,3,分類： 按維生素溶解性能可將它們分成兩大類： 一類是能溶在脂肪或脂溶性溶劑中的，叫脂溶性維生素（如A、D、E、K等）； 另一類是能溶解在水中的，叫水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、 B12等）。,4,2、測定的目的和意義,多數(shù)維生素的性質(zhì)是不穩(wěn)定的，對光、氧、熱、PH等非常敏感，食物在加工、儲存、運輸、銷售等一系列環(huán)節(jié)都可能造成維生素的損失。為了彌補這種損失，維生素常常作為強化劑在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中使用。,5,意義： （1）可評價食品的營養(yǎng)價值； （2）開發(fā)利用富含維生素的食品； （3）可以研究食品在不同的加工、儲存條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)而指導(dǎo)人們制定合理的工藝條件，減少維

3、生素的損失； （4）起到監(jiān)督維生素強化食品的劑量，以防攝入過多的維生素而引起中毒。,6,3、維生素的測定方法 微生物法：基于某種微生物生長需要特定的維生素，方法特異性強、靈敏度高、不需要特殊儀器，樣品不需經(jīng)特殊處理，但只能測定水溶性維生素。 化學(xué)法：比色法、滴定法 儀器法：色譜法、熒光法、酶法、免疫法等。特別是HPLC可用于大多數(shù)維生素的測定，并且在某些條件下可同時分析幾種維生素，但分析費用較高。 應(yīng)根據(jù)不同的食品基質(zhì)和條件選擇不同的分析方法,7,重點講解的方法： 高效液相色譜法（HPLC法）同時測定脂溶性維生素A和維生素E 比色法測定維生素A HPLC法測定胡蘿卜素 熒光法測定 B1、B2

4、滴定法和比色法測定維生素C,8,5.7.2 維生素A、E的測定（HPLC法）,VA的性質(zhì)： 維生素A是-紫羅酮環(huán)與一元醇所組成的一類化合物及其衍生物的總稱。通常所說的維生素A是指視黃醇或視黃醇醋酸酯。 因有許多不飽和鏈，故見光易分解； 在缺氧情況下，對熱較穩(wěn)定，對光特別敏感。如測強化奶粉時，速度要快，一般要求測定時間長短，因為時間長，見光時間長，見光分解，故測出的比出廠的含量要少； 不溶于水，溶于有機溶劑，對堿穩(wěn)定；,9,VE的性質(zhì)：又稱生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)的有8種異構(gòu)體，最常見的有、-生育酚。溶于脂溶性溶劑，對熱穩(wěn)定，酸性環(huán)境中比堿性環(huán)境中穩(wěn)定，無氧條件下，對熱、光及堿性環(huán)境中也相對穩(wěn)定。V

5、E廣泛分布在各種糧食的胚和植物油中。,10,測定原理： （1）液相色譜的原理：液相色譜是采用液體為流動相的一種色譜法。高效液相色譜儀由高壓泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測器、記錄和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。高壓泵以恒定的流量，從貯液容器吸取作為流動相的溶劑輸送到色譜柱，試樣由進(jìn)樣裝置導(dǎo)入，隨流動相在色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離。分離后的組分進(jìn)入檢測器檢測，并用記錄儀繪出色譜圖，或與其他數(shù)據(jù)處理裝置相連，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 色譜圖：某一波長下各個不同時刻的吸光度值描點作圖。,11,（2）高效液相色譜檢測樣品中的維生素A、E的原理：樣品中的維生素E及維生素A經(jīng)皂化提取處理后，將其從不皂化部分提取至有機溶劑中。

6、用高效液相色譜法C18反相柱將維生E和維生素A分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用內(nèi)標(biāo)法定量,12,（3）什么是內(nèi)標(biāo)法？ 取標(biāo)準(zhǔn)被測成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高的比例為縱坐標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)被測成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比或標(biāo)準(zhǔn)被測成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液，調(diào)制試樣液時，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時的同樣條件下得出色譜圖，求出被測成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高之比，再按標(biāo)

7、準(zhǔn)曲線來求出被測成分的含量。 內(nèi)標(biāo)物的選取原則：能與被測成分完全分離，但其保留時間又盡可能接近被測成分的穩(wěn)定的物質(zhì)。,13,試劑 （1）無水乙醚：不含有過氧化物。 （2）無水乙醇：不得含有醛類物質(zhì)。 （3）無水硫酸鈉。 （4）甲醇：重蒸后使用。 （5）重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。 （6）抗壞血酸溶液（100gL）：臨用前進(jìn)行配制。 （7）氫氧化鉀溶液（50g100g）：取50g氫氧化鉀,溶于50g水中，混勻,14,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）維生素 A標(biāo)準(zhǔn)液：視黃醇（純度85）或視黃醇乙酸酯（純度90）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL。臨用前用紫

8、外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。 （2）維生素E標(biāo)準(zhǔn)液：a-生育酚（純度95），-生育酚（純純95）， -生育酚（純度95）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL,臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。 （3）內(nèi)標(biāo)溶液：稱取苯并芘（純度98），用脫醛乙醇配制成10ug/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。,15,儀器和設(shè)備 （1）高效液相色譜儀帶紫外分光檢測器。 （2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。 （3）高速離心機（帶小塑料離心管） （4）高純氮氣。 （5）紫外分光光度計。,16,樣品處理 （1）皂化： 稱取適量樣品（含維生素A約3g，維生素E各異構(gòu)體約40 g ）于三角瓶中，加3

9、0mL無水乙醇，振搖使樣品分散。加入 5mL100gL抗壞血酸溶液和 2.0mL苯并芘內(nèi)標(biāo)液，混勻，加 10mL氫氧化鉀溶液（50濃度），混勻，于沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷卻。 思考： 1、皂化時加入Vc的作用是什么？,17,（2）提?。?將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL無水乙醚分2次洗皂化瓶及殘渣，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖2min，靜置分層，棄去水層。然后每次用約50mL水將乙醚液洗至中性，需洗45次,18,（3）濃縮： 將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉（約5g）濾入150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約15mL

10、乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，于55水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，醚剩下約2mL時，取下蒸發(fā)瓶，用氮氣吹干乙醚，隨即加人2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移人塑料離心管中，于離心機上離心5min（5000rmin），上清液供色譜分析用。,19,液相色譜推薦條件： 分析柱：C18反相柱 5m，4.6mmX25Cm； 流動相：甲醇：水=98：2，混勻，臨用前 脫氣； 紫外檢測器波長：300nm; 進(jìn)樣量：20 L； 流速：1.70mL/min。,20,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 （1）.維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：取上述配制的維生素A、E的標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，在下表要求的

11、條件下測定其吸光度，根據(jù)其吸光系數(shù)計算其準(zhǔn)確濃度。,21,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計算： p-某維生素濃度，mgmL； A-維生素的平均紫外吸光值； E-某種維生素l比吸光系數(shù); F-稀釋倍數(shù)。,22,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備: 本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。把高、低兩個濃度的維生素A、-生育酚、a-生育酚、 -生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并芘液混合，（其內(nèi)標(biāo)苯并芘的濃度值相同）將二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見色譜圖。以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素的濃度(ug/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,23,24,樣品分析： 取樣品處理液20 L，用標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的條件進(jìn)行色譜分析，繪制色譜圖。 定性：根據(jù)保留時間定性

12、 定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此比值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測維生素的含量。,25,計算： 式中： X某種維生素的含量，mg100g； p由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量， g/mL； V樣品濃縮后定容體積，mL； m樣品質(zhì)量，g。,26,說明及討論 （1）維生素極易被光破壞，實驗操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。 （2）乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。 （3）本法是國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，適用于各種食物和飼料中維生素A和維生素E的同時測定。 （4）本法不能將-生育酚-生育酚分開，所以-生育酚

13、的色譜峰中含有-生育酚。,27,（5）維生素的含量可用國際單位（IU）表示： 1國際單位（IU）=0.3 ug維生素A =1mg維生素E =0.025 ug維生素D,28,5.7.3 維生素A的測定（三氯化銻比色法） 原理： VA+三氯化銻藍(lán)色物質(zhì)，于620nm測吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。 試劑： 無水Na2SO4、乙酸酐：吸水 乙醚：抽提 乙醇、KOH：皂化反應(yīng) 三氯甲烷：溶劑 三氯化銻-三氯甲烷：反應(yīng)試劑 酚酞：用于鑒別洗滌液中有無堿,29,步驟： （1）預(yù)處理：皂化、提取、洗滌、濃縮 （2）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：用VA標(biāo)準(zhǔn)液繪制，用CHCl3調(diào)零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測定 (

14、3)樣品測定：用樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)液溶液。,30,說明 (1)萃取時,不要用力過猛,避免發(fā)生乳化。 （2）氯仿中必須無水，因三氯化銻遇水會出現(xiàn)沉淀，干擾比色測定。 （3）由于三氯化銻與VA所產(chǎn)生的蘭色物質(zhì)不穩(wěn)定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測定。 （4）三氯化銻腐蝕性強，且遇水生成白色沉淀，實驗用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。,31,5.7.4、-胡蘿卜素的測定（HPLC法）,試樣中的-胡蘿卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，經(jīng)三氧化鋁柱純化，然后以高效液相色譜法測定，以保留時間定性，以峰高或峰面積定量。 注意：濃縮提取液時，防止蒸干，避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等

15、破壞。,32,5.7.5、維生素B1的測定熒光法,原理：硫胺素（VB1）在堿性鐵化鉀溶液中被氧化為嘧噻色素，在紫外線照射下，嘧噻色素發(fā)出熒光。在給定條件下，以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時，熒光強度與嘧噻色素成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。 試樣在硫酸作用下,加熱提取VB1.冷卻后用淀粉酶在pH=4.5時處理使VB1分離如果樣品中含雜質(zhì)過多，應(yīng)經(jīng)離子交換劑處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液做測定。 測定步驟：提取凈化氧化測定 加入淀粉酶的作用:使結(jié)合態(tài)VB1變?yōu)橛坞x態(tài)VB1.,33,5.7.6、維生素B2的測定熒光法,原理：試樣在稀鹽酸中水解、酶解，調(diào)整 PH值，過濾除去蛋白質(zhì)等物質(zhì)；試樣溶

16、液經(jīng)高錳酸鉀氧化，除去干擾物，再經(jīng)硅鎂吸附劑的柱層析，提純的核黃素在波長525nm下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中其熒光強度與核黃素的濃度成正比。再加入低亞硫酸鈉，將VB2還原成無熒光的物質(zhì)，然后再測定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光，兩者相差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強度。 測定核黃素的方法還有：微生物法和HPLC法。,34,討論：P202 思考題：1、3、4,35,5.7.7 維生素C（抗壞血酸）的測定,維生素C的生理功能及性質(zhì) 維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C具有較強的還原性，對光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-

17、二酮古樂糖酸，失去生理作用。在食品中，這三種形式均有存在，但主要是前兩者，故許多國家的食品成分表均以抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量表示。,36,維生素C為白色至淺黃色晶體或結(jié)晶性粉末，受光照則逐漸變褐，干燥狀態(tài)下相當(dāng)穩(wěn)定，但在空氣存在下于溶液中則迅速變質(zhì)。還原型維生素 C有強還原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化劑。 在新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。,37,維生素C 的測定方法 維生素C的測定方法有： 2，6-二氯靛酚滴定法、 2，4二硝基苯肼比色法、 熒光法、 高效液相色譜法。 （1）2，6-二氯靛酚滴定法測定的是還原型抗壞

18、血酸，該方法簡便、靈敏， 但特異性差，樣品中的其他還原性物質(zhì)（如鐵離子、銅離子等）會干擾測定，使結(jié)果偏高，對色深樣液的滴定終點不易辨別。,38,（2）2，4二硝基苯肼比色法和熒光法測得的是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。苯肼法操作復(fù)雜，特異性差，易受共存物質(zhì)的影響；熒光法受干擾的影響較小，結(jié)果較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜。 （3）高效液相色譜法可以同時測得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量，具有干擾少，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，靈敏、簡便、快速等優(yōu)點，是上述幾種方法中最先進(jìn)、可靠的方法。但分析成本較高。 主要介紹維生素C常用的測定方法2，6-二氯靛酚滴定法、苯肼比色法,39,（一）2，6-二氯靛酚滴定法,原

19、理： 還原型抗壞血酸可以還原染料2，6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中是粉紅色（在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色），被還原后顏色消失；還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗壞血酸含量成正比。,40,試劑 1%草酸溶液（m/V） 2%草酸溶液（m/V） 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 2，6-二氯靛酚溶液 0.001molL碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液 :精確稱取干燥的碘酸鉀0.3567g，用水稀釋至100ml，取出1mL，用水稀至100mL， 此溶液1mL相當(dāng)于抗壞血酸0.088mg。 1%淀粉溶液（m/V） 6%碘化鉀溶液（m/V）,41,抗壞血酸標(biāo)

20、準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定： 配制：準(zhǔn)確稱取20mg抗壞血酸，溶于1的草酸中，并稀釋至100ml，置冰箱中保存。用時取出5mL，置于50mL容量瓶中，用1草酸溶液定容，配成0.02mg/mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 標(biāo)定：吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液 5mL于三角瓶中，加入 6碘化鉀溶液0.5mL、1淀粉溶液3滴，以0.00lmol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點為淡藍(lán)色。,42,C抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL； V1滴定時消耗 0.001molL碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； V2滴定時所取抗壞血酸的體積，mL； 0.088lmL0.001mol碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量，mgmL 一般抗壞血酸純度為99.5%

21、以上，可不標(biāo)定，但要現(xiàn)用現(xiàn)配,43,2.2 2，6-二氯靛酚溶液的配制和標(biāo)定 配制：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，待冷，置于冰箱中過夜。次日過濾于250mL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期標(biāo)定1次。 標(biāo)定：取5mL已知濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1草酸溶液5mL，搖勻，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色，在15s不褪色為終點。,44,計算: 式中： T每毫升染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸 的毫克數(shù)，mgmL； c抗壞血酸的濃度，mgmL； V1抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； V2消耗 2，6- 二氯靛酚的體積，mL,45,測定步驟, 提取: 鮮

22、樣的制備: 稱100g鮮樣，加等量的2草酸溶液，倒入組織搗碎機中打成勻漿。取1040g勻漿于100mL 容量瓶內(nèi)，用1草酸稀釋至刻度，混合均勻。 干樣的制備: 稱14g干樣放入乳缽內(nèi)加 l草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用 1草酸稀釋至刻度。過濾上述樣液，不易過濾的可用離心機沉淀后，傾出上清液過濾備用。,46,滴定： 吸取 510mL濾液，置于 50mL三角瓶中，快速加入 2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到紅色不能立即消失，而后再盡快地一滴一滴的加入（樣品中可能存在其他還原性雜質(zhì)，但一般雜質(zhì)還原染料的速度均比抗壞血酸慢），以呈現(xiàn)的粉紅色在15s內(nèi)不消失為終點。同時做空白。,47,結(jié)果計算

23、 式中：x-樣品中抗壞血酸含量，mg100g； T-1mL染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mgmL； A稀釋倍數(shù) V-滴定樣液時消耗染料的體積，mL； V0-滴定空白時消耗染料的體積，mL； m-樣品的質(zhì)量，g。,48,說明, 所有試劑最好用重蒸餾水配制。 樣品采取后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止維生素C氧化損失。測定時整個操作過程要迅速，防止抗壞血酸被氧化。 若測動物性樣品，須用10%三氯乙酸代替2%草酸溶液提取。 若樣品濾液顏色較深，影響滴定終點觀察，可加入白陶土再過濾，過濾后要迅速滴定。 若樣品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等還原性雜質(zhì)時，會使結(jié)果

24、偏高。,49,（二） 2，4二硝基苯肼比色法,原理 總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸，樣品中還原型抗血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼生成紅色的脎，在濃硫酸的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無水化合物雙-2，4-二硝基苯，在濃硫酸中顯色穩(wěn)定，吸光度的大小與總抗壞血酸含量成比，進(jìn)行比色定量。,50,操作過程： 樣品處理氧化 呈色 硫酸處理 比色 數(shù)據(jù)處理 （1）樣品制備：同2，6-二氯靛酚滴定法 （2）氧化處理：取 25mL上述濾液，加入 2g活性炭，振搖 lmin，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL此氧化提取液，加入 10mL 20g/L的硫脲溶液，混勻。,51,（3）呈色反應(yīng)： 于三個試管中各加入4mL經(jīng)氧化的樣品稀釋液,一個試管作為空白，在其余試管中加入1.0mL 20gL 2，4-二硝基苯肼溶液，將所有試管放入（37士0.5）恒溫箱或水浴中，保溫3h。3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠芾涞绞覝?，然后加入 1.0mL 20gL 2,4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置1015min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同樣品。,52,（4）硫酸（91）處理 當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管中加入5mL