動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù).ppt

1、動物細胞工程常用的技術(shù) 動物細胞培養(yǎng)：其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。 動物細胞核移植 動物細胞融合 生產(chǎn)單克隆抗體等,應(yīng)用：燒傷病人皮膚移植?？苟狙澹贵w的獲得）,用培養(yǎng)的人細胞構(gòu)建的人造皮膚,一動物細胞培養(yǎng),概念：動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.,原理：細胞增殖,培養(yǎng)基：液體,動物體細胞大都生活在液體的環(huán)境,相關(guān)概念 選材： 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。 分散成單個細胞（消化）：在進行動物細胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋

2、白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,補充：胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白質(zhì)外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白。 動物細胞生長特性： 細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。 要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。 細胞的接觸抑制：當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。,原代培養(yǎng)：將動物組織消化后的初次培養(yǎng)。從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中

3、取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 補充：原代培養(yǎng)的細胞生長，繁殖一定時間后，會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，細胞就會停止分裂增殖，因此需要重新用胰蛋白質(zhì)酶等處理，進行分瓶擴大培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)。,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,胰蛋白酶處理分散成單個細胞,10代細胞,原代培養(yǎng),無限傳代,部分細胞的細胞核型可能發(fā)生變化,遺傳物質(zhì)未改變，保持正常的二倍體核型,細胞株：傳代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40-50代，這種傳代細胞為細胞株。 細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在

4、培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。 細胞株和細胞系的區(qū)別： 細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,胰蛋白酶,單個細胞,加培養(yǎng)液,制成,細胞懸浮液,細胞株,細胞系,細胞增殖,無限傳代,去掉組織間蛋白,過程：,動物細胞培養(yǎng)不能 最終培養(yǎng)成生物體,補充：1為何細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長？ 細胞有接觸抑制的現(xiàn)象。 2為何要定期用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上 脫離下來，為何要攪拌？ 分散成單個細胞便于從培養(yǎng)液中獲得營養(yǎng)， 排出代謝廢物，利于繼續(xù)培養(yǎng) 3比較動物和植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分。都有糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素

5、等 動物細胞培養(yǎng)液中還需加入動物血清、血漿等天然成分。,動物細胞培養(yǎng)的條件 1無菌、無毒的環(huán)境 （對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，添加一定量的抗生素，以防止培養(yǎng)過程中的污染，定期更換培養(yǎng)液，以清除代謝產(chǎn)物，防止細胞代謝產(chǎn)物積累對細胞自身造成危害。）,2營養(yǎng) 細胞體外培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)基本相同。（葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、維生素、動物血清等。） 合成培養(yǎng)基：按營養(yǎng)物質(zhì)種類及數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基：由于科學(xué)家對細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此，需加入血清，血漿等一些天然成分。,補充：為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？ 血清中含有蛋白質(zhì)、氨

6、基酸、葡萄糖、激素等多種營養(yǎng)； 還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養(yǎng)時，一般需添加10%20%的血清。,3溫度和PH 36.50.5度, 7.2-7.4 4氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,細胞的全能性,細胞株、細胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,獲得細胞或細胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、動物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細胞增殖,原理,動物細胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項目,植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較,動物細胞培養(yǎng)應(yīng)用 大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒

7、疫苗、干擾素、單克隆抗體） 作為基因工程中的受體細胞 培養(yǎng)的動物細胞可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù),二動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物 動物細胞與植物細胞不同，動物細胞的全能性會隨著動物細胞分化程度的更高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)酢Ｒ虼?，目前還不能用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物個體，用動物體細胞克隆動物，實際是通過核移植來實現(xiàn)。動物細胞的細胞核具有全能性。,概念：將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。 用核移植的方法得到的動

8、物稱為克隆動物。 類型：胚胎細胞核移植，體細胞核移植。其中胚胎細胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易，核移植更容易成功。 受體細胞：M期的卵母細胞 原理：動物細胞的細胞核的全能性。,誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細胞，完成細胞分裂和發(fā)育進程。,取供體細胞,取卵母細胞,供體細胞培養(yǎng),培養(yǎng)到 M中期,卵母細胞去核,供體細胞注入去核的卵母細胞,供體核進入受體卵母細胞,重組胚胎,代孕母牛,生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的個體,過程：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進程,2、保護瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和衰老過程；追蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾病,體細胞核移

9、植技術(shù)的應(yīng)用前景及克隆動物的研究意義：,體細胞核移植技術(shù)存在的問題： 1許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。 2成功率非常低 3克隆動物食品的安全性問題。,討論： 1在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？ 為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?2用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，想一想，這是為什么？ 培養(yǎng)的動物細胞一般當(dāng)傳代至1050代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質(zhì)可

10、能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。,3你認為用上述體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？ 絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細胞。 此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復(fù)制。,思考與探究

11、 2動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？ 動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。,31997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。,可以。盧

12、辛達的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進程。 該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達的任務(wù)交給你，你將如何對它進行克?。?從盧辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯

13、微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。,4體細胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。 研究方面：克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。 應(yīng)用上：生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。,1.下列哪項屬于克隆（ ） A將雞的某個DNA片

14、段整合到小鼠的DNA分子中 B將抗藥菌的某基因引入草履蟲的細胞內(nèi) C將鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)過免疫的脾細胞融合成雜交瘤 細胞 D將某腫瘤細胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個細胞系,D,2.（多選）美國杜克大學(xué)醫(yī)療中心的一個研究小組利用 成年豬的動脈血管細胞和模擬胚胎環(huán)境的新型生物反應(yīng) 器,成功地在實驗室里培育出新的動脈血管，這種血管的 外形和功能都與真的血管一樣,這一研究成果是生物組織 培養(yǎng)領(lǐng)域的重大進展。下列關(guān)于以上技術(shù)的敘述中，正 確的是（ ） A屬于“克隆” B可能要利用去核卵細胞 C關(guān)鍵是激發(fā)血管細胞的全能性 D關(guān)鍵是激發(fā)血管細胞發(fā)育成血管的潛能,ABD,3 .從母羊甲的體細胞中取出細胞核，注入到母羊乙去掉 核的卵細胞中，融合后的細胞經(jīng)卵裂形成早期胚胎，再植 入到另一只母羊丙的子宮內(nèi)，出生小羊的大多數(shù)性狀 （ ） A、難以預(yù)測 B、像甲 C、像乙 D、像丙 4.生物技術(shù)的發(fā)展速度很快，已滅絕生物的“復(fù)生”將不再 是神話。如果世界上最后一只野驢剛死亡，以下較易成功 “復(fù)生”野驢的方法是 （ ） A將野驢的體細胞取出，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)脫分 化、再分化，培育成新個體 B將野驢的體細