二微生物工程的定義.ppt

1、三、微生物工程的研究內(nèi)容,菌種的特性與選育 培養(yǎng)基的配制、選擇及其滅菌理論,發(fā)酵醪的特性 發(fā)酵機理 發(fā)酵過程動力學 空氣除菌 微生物對氧的吸收與利用 微生物的培養(yǎng)方式及自動化控制等,上游工程,發(fā)酵工程,下游工程,發(fā)酵液預處理 初步純化（即提取） 高度純化（即精制） 成品加工,微生物過程廢棄物的處理,發(fā)酵的流程,空氣,空氣凈化處理,保藏菌種,斜面活化,擴大培養(yǎng),種子罐,主發(fā)酵,碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì),滅菌,產(chǎn)物分離純化,成品,1天然發(fā)酵期：只知其然而不知其所以然的時期,2奠基期：純培養(yǎng)技術的建立是第一代微生物發(fā)酵技術,3發(fā)展期：一系列新技術的建立，使微生物發(fā)酵技術得到快速發(fā)展,4. 第三代

2、微生物發(fā)酵技術 一微生物工程,一、微生物工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應用,二、微生物工程在食品工業(yè)中的應用,三、微生物工程在農(nóng)業(yè)中的應用,四、微生物工程在化工能源領域中的應用,五、微生物工程在環(huán)保領域的應用,六、微生物工程在冶金領域的應用,七、微生物工程在高新技術研究中的應用,第五節(jié) 微生物工程的發(fā)展趨勢,（1） 與微生物生態(tài)學相結(jié)合，研究傳統(tǒng)釀造工業(yè),（2） 與遺傳學相結(jié)合，改良菌種，生產(chǎn)出更多更好的產(chǎn)品,（3） 與化學工程結(jié)合，使生產(chǎn)向大型化連續(xù)化方向發(fā)展,（4） 與計算機科學技術結(jié)合，使生產(chǎn)向自動化方向的發(fā)展,體積小、面積大，,吸收快、轉(zhuǎn)化快，,生長旺、繁殖快，,易變異、適應性強，,種類多、分布廣

3、,一、微生物的特性,第一節(jié) 微生物工程對菌種的要求,1，能夠利用廉價的原料來高效地合成產(chǎn)物。 2，菌種遺傳性能要相對穩(wěn)定。 3，菌種改造的可操作性要強。 4，不易感染噬菌體。 5，產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物應該無毒。 6，生產(chǎn)特性要符合工藝要求。,二、工業(yè)化對菌種的要求,二、分離思路,新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。,(1)認真考慮它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程； (2)制訂初步的篩選標準； (3)將生態(tài)學方法運用到分離和篩選過程。,三、新種分離與篩選的步驟,定方案,采 樣,增 殖,分 離,發(fā)酵性能測定,第四節(jié) 生產(chǎn)用菌種的

4、選育,工業(yè)菌種的選育： 是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。,基因突變：,自然選育、誘變育種,基因重組：,雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程,基因的直接進化：,點突變、易錯PCR、同序法 DNA Shuffling等,菌株選育方法,工業(yè)菌種改良方法,(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟,(2)增加前體物的濃度,(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。,(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。,(5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。,(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制

5、。如誘導代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。,自然選育操作步驟：,一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。,單細胞(孢子)懸液的制備,平板分離,挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察),發(fā)酵試驗,一、自然選育,營養(yǎng)缺陷型的選育,營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。 與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。,專題,篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟,誘變 淘汰野生型 抗生素法、菌絲過濾、高溫殺菌 檢出缺陷型 點植法、影印、限量補充培養(yǎng) 確定生長譜 缺陷菌株對生長因子的需求情況（維生素、氨基酸、堿基）,宿主細胞必須符合以下條件：,、對載體的

6、復制和擴增沒有嚴格的限制； 、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA； 、重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾； 、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組； 、容易導入重組DNA分子； 、符合重組DNA操作的安全標準。,一、理想的菌種保藏方法應具備的條件,長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀，簡便、經(jīng)濟。,二、菌種保藏基本原理,菌種保藏一般采取降低培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、低溫、干燥和真空等方法。,三、微生物菌種保藏技術, 斜面保藏法和礦物油保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷凍干燥保藏法 液氮保藏法 低溫保藏法 懸液保藏法,第一節(jié) 微生物的代謝類型,代謝（metabolism）：,細胞內(nèi)發(fā)生的各種化學反應的總稱,復雜分子

7、（有機物）,分解代謝,合成代謝,簡單小分子,ATP,H,分解代謝和合成代謝間的聯(lián)系,中間代謝產(chǎn)物的重要性,微生物糖代謝的途徑,EMP途徑，又稱糖酵解途徑或已糖二磷酸途徑,HMP途徑（Hexose monophosphate pathway ）， 又稱PPP途徑或己糖-磷酸途徑,ED途徑（Entner-Doudoroff pathway）， 又稱2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途徑或KDPG途徑,TCA循環(huán)（tricarboxylic acide cycle） ，即三羧酸循環(huán),EMP途徑的生理功能：,供應ATP形式的能量和NADH2形式的還原力； 是連接其它幾個重要代謝途徑的橋梁，包括三羧

8、酸循環(huán)(TCA)、HMP途徑和ED途徑等； 為生物合成提供多種中間代謝物； 通過逆向反應可進行多糖的合成。,HMP途徑在生命活動中的意義：,供應合成原料，提供多種形式的C架；,產(chǎn)生大量的還原力NADPH+H+；,是光能和化能自養(yǎng)微生物固定CO2的重要中介；,擴大碳源利用范圍，為微生物利用C3C7多種碳源提供了必要的代謝途徑；,連接EMP途徑，可為生物合成提供更多的戊糖。,ED途徑的特點： 具有一特征性反應KDPG裂解為丙酮酸和3磷酸甘油醛； 存在一特征性酶KDPG醛縮酶； 其終產(chǎn)物2分子丙酮酸的來歷不同，即一個由KDPG裂解而來，另一個由EMP途徑轉(zhuǎn)化而來。,TCA循環(huán)的特點：,氧雖不直接參與

9、反應，但必須在有氧的條件下運轉(zhuǎn)（因NAD和FAD再生時需氧）； 產(chǎn)能效率極高； TCA位于一切分解代謝和合成代謝中的樞紐地位，為微生物的生物合成提供各種碳架原料。,EMP、HMP和TCA循環(huán)是重要的兼用代謝途徑,在兼用代謝途徑中，合成途徑并非分解途徑的完全逆轉(zhuǎn)；在分解與合成代謝途徑中，在相應的代謝步驟中，往往還包含了完全不同的中間代謝物。,代謝物回補順序：又稱補償途徑或添補途徑，就是指能補充兼用代謝途徑中因合成代謝而消耗的中間代謝物的反應。,乙醛酸循環(huán),微生物細胞的代謝調(diào)節(jié)主要類型,4，代謝速度的調(diào)控,酶活性調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)的是已有酶分子的活性。,酶合成的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)的是酶分子的合成量。,在酶化學水平

10、上發(fā)生的,在遺傳學水平上發(fā)生的,4.1 酶合成的調(diào)節(jié),根據(jù)酶合成的方式，細胞內(nèi)的酶可分為兩大類：一類是組成酶；另一類是誘導酶。,粗調(diào),凡能促進酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導。 能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象，則稱為阻遏。,以酶的合成系統(tǒng)為基礎的酶量調(diào)節(jié)，包括底物對酶合成系統(tǒng)的誘導作用和產(chǎn)物對酶合成系統(tǒng)的阻遏作用。,酶合成的調(diào)節(jié),與調(diào)節(jié)酶活性的反饋抑制等相比，調(diào)節(jié)酶的合成（即產(chǎn)酶量）而實現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式。,優(yōu)點：通過阻止酶的過量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。,在正常代謝途徑中，酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩者是同時存在且密切配合、協(xié)調(diào)進行的。,4.2 酶活性的調(diào)節(jié),概 念 酶活

11、性調(diào)節(jié)是指一定數(shù)量的酶，通過其分子構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)其催化反應的速率。,影響因素 底物和產(chǎn)物的性質(zhì)和濃度 環(huán)境因子(如壓力、pH、離子強度和輔助因子等) 其他的酶的存在,調(diào)節(jié)方式 激活已有酶的活性 抑制已有酶的活性,細調(diào),初級代謝和次級代謝,一般將微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的自身繁殖所必需的物質(zhì)和能量的過程，稱為初級代謝,該過程所產(chǎn)生的產(chǎn)物即為初級代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷類，以及酶或輔酶等。 次級代謝是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對于該微生物沒有明顯的生理功能且非其生長和繁殖所必需的物質(zhì)的過程。這一過程的產(chǎn)物，即為次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、激素、生物堿、毒素及維

12、生素等。,二、 初級代謝的調(diào)節(jié),產(chǎn)能代謝的調(diào)節(jié)：能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation) 核蛋白體合成的調(diào)節(jié)（Regulation of Ribosome Synthesis） 氨基酸、核苷酸合成代謝的調(diào)節(jié)（Regulation of amino acids and nucleotide metabolism）,三、次級代謝的調(diào)節(jié),初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié) 碳代謝物的調(diào)節(jié)作用 氮代謝物的調(diào)節(jié)作用 磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用 次級代謝中的誘導作用及產(chǎn)物的反饋作用 次級代謝中細胞膜透性調(diào)節(jié),一、微生物代謝產(chǎn)物的利用 利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的眾多代謝產(chǎn)物生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品。 按照積累產(chǎn)物類

13、型： 初級代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷類，以及酶或輔酶； 次級代謝產(chǎn)物，抗生素、激素、生物堿、毒素及維生 素等。 按照發(fā)酵類型： 自然發(fā)酵：酒精、乳酸等， 代謝控制發(fā)酵：終端產(chǎn)物，賴氨酸、鳥苷酸、腺苷酸等； 中間產(chǎn)物，檸檬酸、-酮戊二酸、琥珀酸、 高絲氨酸、肌苷酸、黃苷酸等；,第三節(jié) 微生物的代謝調(diào)控和代謝工程,第四章 發(fā)酵工藝條件的確定,第一節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和確定 第二節(jié) 溫度對發(fā)酵的影響及控制 第三節(jié) 發(fā)酵過程的pH控制 第四節(jié) 氧、二氧化碳和泡沫對發(fā)酵的 影 響與控制 第五節(jié) 微生物培養(yǎng)過程的參數(shù)檢測,第一節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和確定,一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 二、培養(yǎng)基的用途 三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

14、四、發(fā)酵培養(yǎng)基成分的營養(yǎng)與作用 五、發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法,二、培養(yǎng)基的用途,篩選菌種 保藏菌種 檢驗雜菌 培養(yǎng)種子 發(fā)酵生產(chǎn),（一）、培養(yǎng)基的分類 （二）、發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型,（一）、培養(yǎng)基的分類,（1）按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分,（2）按物理性質(zhì),（3）按用途,合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基,選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基等,五、培養(yǎng)基確定方法,（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來源、生活習性、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求。,（2）其次，對生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選

15、擇培養(yǎng)基時做到心中有數(shù)。,第二節(jié) 溫度對發(fā)酵的影響及控制,在生物學范圍內(nèi)通常每升高10，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。,微生物可生長的溫度范圍較廣:-10-95。 任何微生物的生長都需要有最適的生長溫度，在此溫度范圍內(nèi)微生物生長繁殖最快。,二、溫度的影響與控制,（一）溫度對發(fā)酵的影響,1、溫度影響反應速率,發(fā)酵過程的反應速率實際是酶反應速率，酶反應有一個最適溫度。 從阿累尼烏斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 積分得 E=,E活化能,Kr速率常數(shù),2、溫度影響發(fā)酵方向,3、溫度還影響基質(zhì)溶解度，同時氧在發(fā)酵液中的溶解度也影響

16、菌對某些基質(zhì)的分解吸收。 因此對發(fā)酵過程中的溫度要嚴格控制。,溫度變化及其控制,溫度對發(fā)酵的影響： 溫度影響反應速率 溫度影響發(fā)酵方向,最適溫度的選擇,根據(jù)菌種 生長階段選擇 根據(jù)培養(yǎng)條件選擇 菌種的生長情況,發(fā)酵過程引起溫度變化的因素 發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過程溫度變化的原因 Q發(fā)酵Q生物Q攪拌Q蒸發(fā)Q輻射,小 結(jié),小 結(jié),發(fā)酵過程pH會發(fā)生變化,變化原因,基質(zhì)代謝,產(chǎn)物形成,菌體自溶,發(fā)酵過程的pH控制,2、溶氧對發(fā)酵的影響,由此可知，只有使溶氧濃度高于其臨界值，才能維持菌體的最大比攝氧率，得到最大的菌體合成量。如果溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受到干擾。,氧是制約發(fā)酵進行的重要因素,根據(jù)需氧不

17、同，可將初級代謝發(fā)酵分為： a. 供氧充足條件下，產(chǎn)量最大；若供氧不足，合成受強烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等；,b.供氧充足條件下，可得最高產(chǎn)量；若供氧受限，產(chǎn)量受影響不明顯；如：異亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸等；,c.若供氧受限，細胞呼吸受抑制時，才獲得最大量產(chǎn)物；若供氧充足，產(chǎn)物形成反而受抑制；如：亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸等。,（二）起泡的危害,降低發(fā)酵設備的利用率 增加了菌群的非均一性 增加了染菌的機會 導致產(chǎn)物的損失 消泡劑會給后提取工序帶來困難,3、對消泡劑的要求,（1）在起泡液中不溶或難溶,（2）表面張力低于起泡液,（3）與起泡液有一定程度的親和性,（4）與起泡液不發(fā)生化學反應,

18、（5）揮發(fā)性小，作用時間長,4、常用消泡劑的種類和性能,（1）天然油脂,（2）聚醚類消泡劑,（3）高碳醇,（4）硅酮類,對數(shù)期：t = 0+ t,-比生長速率,-菌體濃度,延滯期、加速期、對數(shù)期、減速期、靜止期和死亡期,max,微生物生長分為四個時期,化學參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等。,代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：,物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣 流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等。,生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、基質(zhì)消耗速率、關鍵酶活力等。,第五章 微生物反應動力學,研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動之間相互作用隨時間

19、而變化的規(guī)律。,微生物反應是非常復雜的反應過程。,一、微生物反應過程的主要特征 微生物是該反應過程的主體。 微生物反應的本質(zhì)是復雜的酶催化反應體系,（1）反應體系中有細胞的生長，基質(zhì)的消耗和產(chǎn)物的生成，有各自的最佳反應條件。,（2）微生物反應有多種代謝途徑。,（3）微生物反應過程中，細胞形態(tài)、組成要經(jīng)歷生長、繁殖、維持、死亡等若干階段，不同菌齡有不同的活性。,二、微生物反應動力學的描述方法,細胞生長動力學,反應基質(zhì)消耗動力學,代謝產(chǎn)物生成動力學,二、培養(yǎng)基滅菌 1，在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：,生產(chǎn)菌和雜菌同時生長，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力；,雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難；,雜菌會

20、污染最終產(chǎn)品；,發(fā)酵時如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。,四、連續(xù)滅菌與分批滅菌,1，連續(xù)滅菌 保留較多的營養(yǎng)質(zhì)量；蒸汽負荷均勻；較易自動控制；容易放大；縮短滅菌周期；發(fā)酵罐利用率高。但是設備比較復雜，投資較大。,2，分批滅菌,設備投資較少；染菌的危險性較小；人工操作較方便；對培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時更為適宜。滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。,三、連續(xù)滅菌 1，連續(xù)滅菌的流程,1，兩級冷卻、分離、加熱的空氣過濾除菌流程,特點是：兩次冷卻，兩次分離， 適當加熱。,二、空氣過濾除菌流程的分析,2，冷熱空氣直接混合式空氣過濾除菌流程,可省第二冷卻分離設備

21、和空氣再加熱設備，流程比較簡單，冷卻水用量較少，利用壓縮空氣的熱量來提高空氣溫度。,3，高效前置過濾除菌流程,特點：無菌程度高,典型發(fā)酵設備,種子制備設備 主發(fā)酵設備 輔助設備(無菌空氣和培養(yǎng)基的制備) 發(fā)酵液預處理設備 粗產(chǎn)品的提取設備 產(chǎn)品精制與干燥設備 流出物回收、利用和處理設備等。,三、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu),1、罐體,2、攪拌器和擋板,3、消泡器,4、聯(lián)軸器及軸承,5、變速裝置,6、空氣分布裝置,7、軸封,8、冷卻裝置,圓筒體錐底發(fā)酵罐的優(yōu)點,加速發(fā)酵；廠房投資節(jié)省，冷耗節(jié)??；C.C.T 發(fā)酵可依賴CIP自動程序清洗消毒，工藝衛(wèi)生更易得到保證。,圓筒體錐底發(fā)酵罐的缺點,酵母沉降層厚度大，酵母泥

22、使用代數(shù)一般比傳統(tǒng)低；貯酒時，澄清比較困難，過濾必須強化；若采用單釀發(fā)酵，罐壁溫度和罐中心溫度一致，一般要57d以上，短期貯酒不能保證溫度一致。,1 自吸式發(fā)酵罐 2 氣泡塔式發(fā)酵罐 3 伍式發(fā)酵罐（循環(huán)機械攪拌） 4 氣升式發(fā)酵罐（循環(huán)通氣攪拌） 4 液提式發(fā)酵罐 5 氣提式發(fā)酵罐,一、其它通氣發(fā)酵罐,二、發(fā)酵輔助設備,發(fā)酵輔助設備主要包括：無菌空氣系統(tǒng)，培養(yǎng)基配制和滅菌系統(tǒng)、發(fā)酵車間的管道及閥門等。,三、管道及閥門,生物反應器過程的多尺度理論 發(fā)酵過程優(yōu)化與放大基礎,第八章 發(fā)酵過程優(yōu)化與放大,發(fā)酵過程優(yōu)化控制中的方法和手段,發(fā)酵過程優(yōu)化控制舉例,生物反應器過程的多尺度理論,生命所特有的信

23、息流、物質(zhì)流、能量流 具有“變化著的結(jié)構(gòu)” 不僅是線性或動力學因素 跨尺度測量與控制 往往以各自研究的技術背景從單一尺度去理解和分析研究生物過程的特點,轉(zhuǎn)速，氣泡，氣液接觸表面積，KLa，OTROUR，DO,理化相關 攪拌轉(zhuǎn)速、通氣流量、罐壓力 溶解氧 DO,rpm,DO,ECO2,EO2,加糖,加糖,ECO2,ECO2,ECO2,EO2,EO2,EO2,DO,DO,DO,rpm,rpm,rpm,h,h,h,h,非碳源限制，臨界氧濃度以下（變化不顯著）,碳源限制，臨界氧濃度以下（變化顯著）,非碳源限制，臨界氧濃度以上（EO2變化不顯著）,碳源限制，臨界氧濃度以上（EO2變化顯著）,生物相關：排氣氧濃度與溶解氧濃度的對應關系 不同發(fā)酵周期的EO2濃度與DO的幾種對應關系。這種不同的對應關系是與不同操作條件和菌體呼吸強度有關的。,OUR,DO,rpm,加糖,DO和OUR之間的動力學特征,O2消耗與過程傳遞的物質(zhì)平衡,時間(h),生物相關：OUR與DO的基本相關特征,OUR:單位體積發(fā)酵液每小時的耗氧量,1